袁 琦，蒲曉輝，詹慕歐洋，李 哲，竟香艷，陳毛芬，周云豐，崔麗麗

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475004）

欒樹屬（Koereuteria）是無(wú)患子科落葉喬木。中國(guó)產(chǎn)有三個(gè)種，一個(gè)變種，分別為欒樹（K.henryi）、臺(tái)灣欒樹（K.paniculata）、復(fù)羽葉欒樹（K.bipinnata），變種為全緣葉欒樹（K.bipinnata var.integrifoliola）。我們主要研究回流提取方法對(duì)欒樹黃酮提取的最佳條件，為更好地利用欒樹資源提供依據(jù)［1－7］。

1 材料和儀器

1.1 材料

欒樹果殼于2012年3 月采自河南大學(xué)金明校區(qū)，自然風(fēng)干，粉碎，裝袋備用。

1.2 儀器與藥品

紫外可見分光光度計(jì)UV－1600（北京瑞麗有限公司）；SHB－III循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，三氯化鋁均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制

稱取蘆丁對(duì)照品0.01051g，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容于50mL容量瓶中，配制成為0.2102g／L蘆丁乙醇溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2 欒樹黃酮類化合物的提取

分別準(zhǔn)確稱取已粉碎的欒樹果皮10.0g，置磨口錐形瓶中，加入一定量不同濃度的乙醇為提取劑。在不同溫度、時(shí)間、料液比等條件下回流提取，確定正交實(shí)驗(yàn)提取因素的數(shù)值。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交法進(jìn)一步確定提取的最佳條件。

2.3 供試品溶液的制備以及含量測(cè)定

欒樹果皮提取液過(guò)濾后的濾液，用相應(yīng)濃度的乙醇定容于500mL容量瓶。吸取1mL置10mL容量瓶中，加50g／L NaNO2溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min 后，加100g／L Al（NO3）3溶液0.3mL，振蕩搖勻，放置6min 后，再加40g／L NaOH 溶液4mL，振蕩搖勻，用體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇定容至刻度，振蕩搖勻，放置1.5h 后，于510nm 測(cè)量吸光度［8－9］。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取0.01051g蘆丁，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶解后，定容于50 mL 容量瓶中，得0.2102g／L 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁對(duì)照液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 分別置10mL 容量瓶中，按照“2.3”項(xiàng)下制備方法制備溶液，放置1.5h后，采用紫外分光光度法，在510nm 處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品濃度（g／L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y＝0.1159 X－0.00914（r＝0.9997），線性范圍（1.051～7.357）×10－2g／L。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液5mL 置10mL 容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇定容。從中吸取3mL 置10mL 容量瓶中，按照“2.3”項(xiàng)下配制溶液后，測(cè)其吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果的RSD為0.19%，說(shuō)明采用該方法測(cè)量黃酮含量時(shí)儀器誤差較小。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別精密稱取欒樹果皮10.0g，稱取5 份，按“2.2”項(xiàng)下制備待測(cè)液，從中吸取1mL，按“2.3”項(xiàng)下配制溶液，在510nm 處測(cè)吸光度，重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果的RSD為0.665%，說(shuō)明方法的重復(fù)性較好。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取條件的確定

3.1.1 提取劑濃度的選擇 黃酮類化合物無(wú)論是游離的黃酮苷元還是黃酮苷都易溶于甲醇、乙醇、丙酮，根據(jù)溶劑的市場(chǎng)價(jià)格以及毒性，采用乙醇進(jìn)行提取。在提取溫度80℃、時(shí)間2h的條件下，采用不同濃度的乙醇溶劑進(jìn)行提取。按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定提取液的吸光度，其結(jié)果見表1。

由表1可以看出，乙醇濃度在體積分?jǐn)?shù)為50%以下時(shí)，提取率隨著濃度的增大而增大，當(dāng)乙醇的濃度在體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，效果最好。但是，隨著濃度增加，提取率反而降低，主要是因?yàn)橐掖紳舛炔煌?，極性也不同。隨著乙醇濃度的升高，一些脂溶性物質(zhì)的溶出增加，影響了黃酮類物質(zhì)的浸出。而體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇極性與黃酮類物質(zhì)的極性相似，所以提取率最高。

3.1.2 提取時(shí)間的選擇 在體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇、提取溫度80℃、料液比1∶15的條件下，改變提取時(shí)間，進(jìn)行提取。按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定提取液的吸光度，結(jié)果見表2。

表1 乙醇濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表2 回流提取時(shí)間數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

由表2 可知，120 min前，黃酮類物質(zhì)還未充分溶出，提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但120 min后變化不大。因?yàn)檫@時(shí)欒樹果皮內(nèi)的黃酮類物質(zhì)溶出已達(dá)到平衡，延長(zhǎng)時(shí)間只能降低效率，因此，提取時(shí)間以120min為宜。

3.1.3 料液比選擇 在其他情況相同條件下，不同料液比對(duì)提取效果有一定的影響。體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇、提取溫度80℃、提取時(shí)間2h、改變料液比，提取黃酮，結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著料液比的減小，提取率增加。但當(dāng)料液比小于1∶25以后，隨料液比的減小，提取率改變不大。從提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮，選用1∶25的料液比較合適。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定每個(gè)因素的3個(gè)水平（見表4），因此，選用L9（33）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［10－11］，以欒樹果皮總黃酮的提取率為考察指標(biāo)。結(jié)果見表5、表6。

3.3 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表7可知，測(cè)定的結(jié)果相比較于正交實(shí)驗(yàn)表中的最佳組合（3.223%）低0.186%，但是從節(jié)約溶劑、時(shí)間上來(lái)看，時(shí)間120 min，料液比1∶30 是比較合適的。

表3 固液比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表4 因素水平設(shè)計(jì)

表5 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)表

表6 方差分析表（%）

表7 最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（%）

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

比較表6中R的大小，可知RB最大，故因素B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大，其次是A和C。比較各個(gè)因素不同水平的綜合平均值，可知最優(yōu)條件是A3B3C1，RA、RC比較小，因此因素A、C 對(duì)結(jié)果影響不大?？紤]到成本問(wèn)題，可以選擇體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇進(jìn)行提取，回流時(shí)間120 min。因此最佳方案為A2B3C3，即體積分?jǐn)?shù)為40%乙醇、時(shí)間120min、料液比1∶30。

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