郭宇玲，陳 麗，劉 佳，孫 哲

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006）

原發(fā)性肺癌（簡(jiǎn)稱肺癌）是嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤之一。 肺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的過程，除環(huán)境因素外，個(gè)體的遺傳易感性因素也是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的重要原因。流行病學(xué)研究［1-2］表明，肺癌具有家族聚集現(xiàn)象，目前家族的遺傳易感性所起的作用逐漸為人們所重視。 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）位于6 號(hào)染色體短臂Ⅲ類MHC 區(qū)域，其啟動(dòng)子區(qū)域存在多種等位基因多態(tài)現(xiàn)象，TNF-α 基因多態(tài)現(xiàn)象與血清TNF-α 表達(dá)水平密切相關(guān)，并與某些腫瘤的易感性有關(guān)。 有資料顯示，TNF-α 基因多態(tài)性可能與肺癌的易感性有關(guān)，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌點(diǎn)數(shù)的80%［3-4］。本研究旨在探討腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2007 年1 月至2012 年1 月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科收治的非小細(xì)胞肺癌患者60 例（肺癌組），均符合病理學(xué)診斷。 其中男38例，女22例，年齡38～82 歲，平均51 歲；鱗癌38 例，腺癌22例。 臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期14 例，Ⅲ+Ⅳ期46 例。 均簽署知情同意書。 另選擇同期門診體檢的健康人62例（對(duì)照組），男45 例，女17 例，年齡35～70 歲，平均47 歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑

基因組DNA 提取試劑盒（北京天為時(shí)代公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京天為時(shí)代公司）、DNA marker（Takara,Japan）、人TNF-α 引物（上海生工公司）、NcoⅠ（Fermentas）、MspⅠ（Fermentas）等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

采集肺癌組患者及對(duì)照組體檢健康者空腹、外周靜脈血2 mL。

1.3.2 基因多態(tài)性分析

采用PCR-RFLP 分析基因型，按照試劑盒操作方法提取全基因組DNA。 PCR 反應(yīng)體系總體積為50 μL，內(nèi)含模板DNA 2 μL ,引物各1 μL，4×dNTP 4 μL，10×butter (不含Mgcl2)5 μL，Mgcl23 μL， Taq酶(3 U·μL-1) 1 μL, 雙蒸水25 μL。 將反應(yīng)液置于PCR 擴(kuò)增儀中，反應(yīng)條件： 預(yù)變性95 ℃5 min，變性95 ℃45 s，退火59 ℃45 s，延伸72 ℃45 s 共40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸10 min。 擴(kuò)增完畢后，取10 mL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用10 U 限制性內(nèi)切酶StyI消化，反應(yīng)體系為總體積20 μL，擴(kuò)增后DNA 10 μL，10×buffer 2.5 μL，BSA 0.3 μL，StyI 酶0.5 μL，雙蒸水6 μL，并在37 ℃水浴中4 h 以上。 用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，電泳分離完畢，置于300 nm 紫外燈下檢測(cè)，觀察電泳條帶，以特定的DNA marker 為參照，確定基因型（封四圖1-2）。TNF-α-308 G/G：-87 bp 條帶；TNF-α-308 A/A：-107 bp 條帶；TNF-α-308 G/A：87 bp、107 bp 2條帶；TNF-α-238 G/G：-152 bp 條帶；TNF-α-238 A/A：-132 bp 條帶；TNF-α-238 G/A：-152 bp、-132 bp 2 條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

基因型和等位基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，各組基因型和等位基因頻率差異比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法檢驗(yàn)來判斷TNF-α 基因-308 G＞/A、-238 G＞/A 多態(tài)現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 基因啟動(dòng)子-308 位點(diǎn)多態(tài)性現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系

肺癌組與對(duì)照組均未檢測(cè)出TNF-α-308 A/A純合子基因型，G/G 基因型頻率在2組的分布中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 鱗癌組與腺癌組、Ⅰ+Ⅱ期組與對(duì)照組的G/G 基因型與G/A 基因型在分布頻率上比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 Ⅲ+Ⅳ期組與對(duì)照組的基因型分布頻率上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 但G/G 基因型與G/A 基因型在不同分期肺癌組中的分布的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 TNF-α-308 位點(diǎn)多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌及病理類型、臨床分期的關(guān)系

2.2 TNF-α 基因啟動(dòng)子-238 位點(diǎn)多態(tài)性現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系

肺癌組與對(duì)照組均未檢測(cè)出TNF-α-238 A/A純合子基因型，G/G 基因型頻率在2組的分布上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。鱗癌組、腺癌組與對(duì)照組相比，G/G 基因型與G/A 基因型頻率分布的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但G/G 基因型與G/A基因型在鱗癌組與腺癌組的分布頻率、腺癌組與對(duì)照組中的分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。Ⅰ+Ⅱ期組與對(duì)照組的基因型分布頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Ⅲ+Ⅳ期組與對(duì)照組的基因型分布頻率上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但G/G 基因型與G/A 基因型在不同分期肺癌組中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表2 TNF-α-238 位點(diǎn)多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌及其病理類型、臨床分期的關(guān)系

3 討論

TNF-α 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，TNF-α 的表達(dá)主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，TNF-α基因啟動(dòng)子的多態(tài)現(xiàn)象和TNF-α 的產(chǎn)物水平相關(guān)［5］。 TNF-α 基因在啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)-308 位點(diǎn)存在著2個(gè)基因多態(tài)：TNF-α1 基因型和TNF-α2 基因型。 分析-308 位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)TNF-α2基因型的患者體內(nèi)TNF-α 水平明顯高于TNF-α1基因型［6-7］。 同樣，TNF-α 基因在啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)-238A位點(diǎn)也存在著基因多態(tài)現(xiàn)象，存在G→A 變化。有研究認(rèn)為，銀屑病患者中-238 A 與TNF-α 的低表達(dá)密切相關(guān)；TNF-α 啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)-308、-238 位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象與肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等惡性腫瘤的易感性有關(guān)［8-10］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：肺癌組及對(duì)照組均未檢測(cè)出TNF-α-308 A/A、TNF-α-238 A/A 純合子，可能與其基因型在人群中分布頻率低及樣本量較小有關(guān)。 肺癌組基因型分布頻率高于對(duì)照組，因此推測(cè)TNF-α-308 位點(diǎn)的基因多態(tài)現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌存在一定的關(guān)聯(lián)。 在Ⅰ＋Ⅱ期組與對(duì)照組的比較中，TNF-α-308 G/A 基因型分布頻率無明顯差異，而Ⅲ＋Ⅳ期組其分布頻率明顯高于對(duì)照組，提示TNF-α-308 A 等位基因?qū)Ψ伟┑陌l(fā)生發(fā)展可能有促進(jìn)作用。肺癌組TNF-α-238 G/A 基因型低于對(duì)照組，說明其等位基因多態(tài)現(xiàn)象與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生也存在關(guān)聯(lián)。 Ⅰ＋Ⅱ期組與對(duì)照組比較，基因型頻率分布無明顯差異，Ⅲ＋Ⅳ期組與對(duì)照組比較，基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α-238 等位基因可能與疾病進(jìn)展有關(guān)，但也可能與樣本含量較小不能進(jìn)行多元回歸分析或基因分布頻率低有關(guān)。 且所研究的對(duì)象均為江西人，因此不能排除人種區(qū)別。 本研究沒有分析基因多態(tài)性對(duì)各種治療的影響，有待于今后密切隨訪患者，擴(kuò)大樣本含量進(jìn)行研究。

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