楊金玲 江 陽(yáng) 薛 勇 孫成均△

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；2四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院研究生，四川 成都610041）

食品防腐劑能防止由微生物引起的腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，已廣泛應(yīng)用于食品中，其中包括飲料。由于食品防腐劑均具有一定毒性，須嚴(yán)格按《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［1］規(guī)定添加，不能超標(biāo)和超范圍使用。為方便飲料中多種防腐劑的快速監(jiān)測(cè)，需建立能同時(shí)測(cè)定多種防腐劑的檢測(cè)方法。目前，食品中防腐劑的測(cè)定方法國(guó)內(nèi)外已有許多報(bào)道［2－7］。但現(xiàn)有方法或操作繁瑣、試劑消耗量大、成本高或不能同時(shí)檢測(cè)多種防腐劑。本研究建立了能夠同時(shí)快速檢測(cè)不同種類飲料中10種防腐劑的毛細(xì)管氣相色譜快速分析方法，采用蒽作內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，優(yōu)化了樣品前處理方法，故本法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于飲料中多種防腐劑的同時(shí)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 6890氣相色譜儀，配備FID檢測(cè)器；標(biāo)準(zhǔn)品丙酸、苯甲酸甲酯、苯甲醇、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、蒽（內(nèi)標(biāo)），含量均大于99%。乙酸乙酯、氯化鈉、鹽酸均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱為FFAP柱（SGE，25m×0.32mm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃，分流比10∶1。程序升溫為初始溫度180℃，保持4min；以40℃／min升至230℃，保持8min。程序升流為初始流速1ml／min，保持3min；以40ml／min升至3ml／min，保持9min；檢測(cè)器溫度為250℃，尾吹流量30ml／min。載氣為氮?dú)猓兌?9.999%），氫氣流量35ml／min，空氣流量350ml／min。進(jìn)樣量1μl。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)20.0mg分別置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成濃度均為2.00mg／ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取蒽10.0mg置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容，配成濃度為1.00mg／ml的內(nèi)標(biāo)溶液；分別吸取一定量各儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為50～400μg／ml（丙酸），20～200μg／ml（苯甲酸甲酯與苯甲醇），20～240μg／ml（山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類）的混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

1.4 樣品前處理

稱?。ɑ蛭。┚鶆蝻嬃蠘悠?.50g（0.50ml）于5ml離心管中（pH值≥4的樣品用鹽酸酸化至pH＜4.0），加入少量氯化鈉固體，準(zhǔn)確加入40μl內(nèi)標(biāo)溶液和960μl乙酸乙酯，漩渦混合3min，6000r／min離心1min，吸取上清液置于比色管中，加入1ml乙酸乙酯再提取一次，合并提取液待測(cè)。對(duì)于基體復(fù)雜的樣品，向提取液中再加2ml飽和氯化鈉溶液洗滌，離心后取上清液待測(cè)。

1.5 測(cè)定

分別進(jìn)樣1μl混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，以各防腐劑濃度對(duì)相應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)（蒽）峰面積之比繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)進(jìn)樣1μl試樣溶液，根據(jù)試樣中被測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較確定進(jìn)樣液中待測(cè)物質(zhì)的含量，再根據(jù)稱樣量和提取液體積計(jì)算樣品中防腐劑含量［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中各組分沸點(diǎn)和極性差異大，為實(shí)現(xiàn)較好分離，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。結(jié)果表明，采用恒溫和恒流模式時(shí)，難以實(shí)現(xiàn)完全分離，故采用程序升溫結(jié)合程序升流模式。進(jìn)樣口溫度低于200℃時(shí)，沸點(diǎn)高的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)難以完全氣化，但溫度過(guò)高，與初始柱溫差距較大，部分組分容易在色譜柱中冷凝，故選擇250℃。較低的檢測(cè)器溫度影響結(jié)果的靈敏度，高于250℃時(shí)，無(wú)明顯變化，故選擇250℃。由于防腐劑在食品中含量較高，不分流進(jìn)樣容易造成色譜柱過(guò)載，溶劑峰拖尾，但當(dāng)分流比過(guò)大時(shí)，分流歧視效應(yīng)增大，沸點(diǎn)高的對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)檢測(cè)靈敏度明顯下降，所以選擇10∶1的分流比。以蒽為內(nèi)標(biāo)物，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)與待測(cè)組分接近，保留時(shí)間位于酸與酯類之間，各組分含量對(duì)其與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)在0.9986～1.000之間。在優(yōu)化色譜條件下的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 10種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 樣品處理方法優(yōu)化

采用液—液萃取方式，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取效率高，簡(jiǎn)化了操作，且響應(yīng)值最高。對(duì)比了超聲提取和漩渦混合提取的效果，發(fā)現(xiàn)漩渦混合提取的效果優(yōu)于超聲提取。由于食品中防腐劑形態(tài)多是待測(cè)組分的鹽類，如山梨酸鉀和苯甲酸鈉，故需用鹽酸酸化使其轉(zhuǎn)變成分子態(tài)可提高萃取效率。但當(dāng)試樣pH低于4時(shí)，無(wú)需酸化。

試驗(yàn)了氯化鈉對(duì)萃取效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)加入氯化鈉時(shí)，可有效減少乳化現(xiàn)象，提高萃取效率。對(duì)于基體復(fù)雜的樣品，如乳飲料，其基質(zhì)效應(yīng)明顯，提取液直接測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)干擾嚴(yán)重，且峰形變差。故采用飽和氯化鈉溶液洗滌提取液后測(cè)定，大大減小了雜質(zhì)干擾。

2.3 線性范圍、線性方程與檢出限

在本色譜條件下，內(nèi)標(biāo)工作曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線之間無(wú)顯著性差異，故用標(biāo)準(zhǔn)曲線代替工作曲線。方法實(shí)際線性范圍很寬，未試驗(yàn)線性范圍上限。各組分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、以3倍噪聲分別計(jì)算的方法檢出限，見(jiàn)表1。

表1 方法線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（n＝6）

2.4 方法的精密度和回收率

以酸乳為樣品，加入不同量標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。除對(duì)羥基苯甲酸乙酯低濃度加標(biāo)回收率在85.0%以下，其他各組分都在85.0%～115%之間。

表2 方法加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

在市場(chǎng)隨機(jī)采集不同種類飲料樣品11份，按本法測(cè)定，結(jié)果表明，所檢飲料中的防腐劑以苯甲酸為主。所檢某冰茶飲料中苯甲酸的含量為0.284g／kg，超出GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定（苯甲酸在碳酸型飲料中最大允許添加量0.2g／kg），而其他樣品中苯甲酸含量均未超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在果酒樣品還同時(shí)檢測(cè)出山梨酸，但未超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在所檢飲料樣品中均未檢出對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑。丙酸在飲料中禁止添加，但在某酸乳飲料中仍檢出丙酸。值得注意的是，在檢出含有防腐劑的6種樣品中，只有2種飲料注明含有防腐劑，其他均未注明。而我國(guó)新頒布的《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》只提出苯甲醇可以添加在食品中，但未明確規(guī)定在食品中的添加限量。這說(shuō)明，飲料行業(yè)不規(guī)范使用食品防腐劑的現(xiàn)象還較常見(jiàn)，某些產(chǎn)品的質(zhì)量仍然不容樂(lè)觀，而我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)仍然有待進(jìn)一步完善。

［1］ GB 2760－2011［M］.食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)，2011：5－72.

［2］ 陳琦，凌云，張峰，等.攪拌棒吸附萃取結(jié)合氣相色譜／質(zhì)譜／質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定飲料和果醬中的7種防腐劑［J］.分析化學(xué)，2010，38（8）：1156－1160.

［3］ 向俊，徐建雙，毛麗秋.液相微萃?。瘹庀嗌V－質(zhì)譜法分析食品中的防腐劑和抗氧化劑［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26（2）：187－190.

［4］ Wang LL，Zhang X，Wang Y，et al.Simultaneous determination of preservatives in soft drinks，yogurts and sauces by a novel solid－phase extraction element and thermal desorptiongas chromatography［J］.Anal Chim Acta，2006，577（1）：62－67.

［5］ Garc?a－Jimenez JF，Valencia MC，Capitán－Vallvey LF.Simultaneous determination of antioxidants，preservatives and sweetener additives in food and cosmetics by flow injection analysis coupled to a monolithic column［J］.Anal Chim Acta，2007，594（2）：226－233.

［6］ 向俊，漆愛(ài)明，毛麗秋.中空纖維膜液相微萃取技術(shù)／氣相色譜－質(zhì)譜法對(duì)食品中防腐劑與抗氧化劑的測(cè)定［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（5）：560－563.

［7］ Scotter MJ，Castle L，Roberts DP，et al.Development and single－laboratory validation of an HPLC method for the determination of cyclamate sweetener in foodstuffs［J］.Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess，2009，26（5）：614－622.

［8］ Yang JL，Li D，Sun CJ.Simultaneous determination of eleven preservatives in foods using ultrasound－assisted emulsification micro－extraction coupled with gas chromatography－mass spectrometry［J］.Anal Methods，2012，4（10）：3436－3442.