復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究所，復(fù)旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

趨化因子CCL28過表達對人乳腺癌細胞增殖的影響

林鳳娟 楊小利 郭雅潔 邵志敏 歐周羅

復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究所，復(fù)旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：CCL28，又稱為黏膜相關(guān)上皮趨化因子(mucosa-associated epithelia chemokine，MEC)，是趨化因子CC家族中的一員。研究表明，CCL28與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但對其在乳腺癌中的功能還知之甚少。本文旨在探討CCL28過表達在體外對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響。方法：構(gòu)建CCL28過表達載體pBabe-CCL28表達質(zhì)粒，將重組的pBabe-CCL28基因和空載體pBabe轉(zhuǎn)染細胞Phoenix，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染乳腺癌細胞MDA-MB-231，通過嘌呤霉素藥物篩選獲得穩(wěn)定表達CCL28的MDA-MB-231/CCL28細胞系和感染空載體的MDA-MB-231/vector細胞系，利用半定量RT-PCR、實時熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測CCL28的基因表達和蛋白質(zhì)水平；利用CCK8、軟瓊脂克隆培養(yǎng)及流式細胞術(shù)檢測CCL28過表達后細胞增殖、克隆形成能力及凋亡的變化；利用Western blot檢測CCL28過表達后凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果：成功建立了穩(wěn)定表達CCL28的細胞系MDA-MB-231/CCL28，與空載體對照組相比，pBabe-CCL28質(zhì)粒感染入細胞后CCL28基因表達水平明顯增高，說明CCL28 cDNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。CCK8及軟瓊脂克隆實驗結(jié)果顯示，MDA-MB-231/CCL28的增殖能力明顯高于MDA-MB-231/vector，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，MDA-MB-231/ CCL28細胞凋亡比例減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加。結(jié)論：CCL28過表達可以顯著促進人乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖能力，抑制乳腺癌細胞凋亡，后者可能與Bcl-2上調(diào)有關(guān)。CCL28有望成為臨床治療乳腺癌的潛在基因靶點。

乳腺腫瘤；趨化因子；CCL28；基因表達；增殖

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤［1-2］，我國乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。近年來，趨化因子受體及其相應(yīng)趨化因子配體已被證明在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，涉及腫瘤的增殖、侵襲、血管形成及腫瘤組織中的免疫細胞［3］。

CCL28，又稱為MEC(mucosa-associated epithelial chemokine)，是最早由Wang等［4］于2000年從鼠的腎臟組織中分離克隆出來的，屬于CC類趨化因子家族。CCL28相應(yīng)的受體為CCR3和CCR10，CCL28能夠調(diào)節(jié)表達有CCR3和CCR10受體細胞的趨化活性。目前對于CCL28的研究集中在其與炎性反應(yīng)、免疫的關(guān)系，而對CCL28在乳腺癌中作用的研究還比較少。因此，本研究利用DNA重組技術(shù)上調(diào)CCL28的表達，觀察CCL28對乳腺癌細胞增殖、克隆形成及凋亡的影響，并初步探討其機理，從而為乳腺癌的治療提供實驗依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗所用的人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)；所有細胞用ATCC推薦的培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)，MDAMB-231用DMEM。傳代時用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。RNA提取試劑TRIzol購自于Invitrogen公司，RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自Fermentas公司，SYBR Green qPCR試劑盒購自Takara公司，Polybrene購自Sigma公司，CCL28 (18214-1-AP，1∶500) 抗體購自proteintech公司，Bcl-2 (sc-7382，1∶500) 抗體購自Santa cruz公司，β-actin (A5441，1∶20 000) 購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測

采用TRIzol法抽提各細胞系的總RNA，Beckman公司DU800紫外分光光度儀對所得RNA進行定量分析。取3 μg的總RNA加入到25 μL的RT反應(yīng)體系中，按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下：10×緩沖液25 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL，基因上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶25 U，RT反應(yīng)產(chǎn)物1.5 μL，滅菌MQ水加至25 μL；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共20個循環(huán)(GAPDH)和30個循環(huán)(CCL28)，經(jīng)預(yù)備實驗確認處于指數(shù)擴增期；PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在紫外光凝膠成像分析系統(tǒng)下攝片，GAPDH引物序列為：上游5’-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游5’-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3’，擴增片段大小353 bp，CCL28引物序列為：上游5’-CCATACTTCCCATTGCCTCC-3’， 下游5’-TGCCCTGTTACTGTTCCTCTTG-3’，擴增片段大小為275 bp。

1.2.2 SYBR Green實時熒光定量PCR法檢測

25 μL反應(yīng)體系中包括上、下游引物各0.5 μL、2×Mix 12.5 μL(含反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、SYBR Green、Taq DNA polymerase)、滅菌MQ水11 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)條件同上。GAPDH和CCL28的讀靶溫度為82 ℃，將監(jiān)測臨界點設(shè)在PCR擴增過程中，熒光信號由本底進入指數(shù)擴增階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標。在擴增效率達95%～105%時，使用2-ΔΔCt法(Ct代表循環(huán)閾值)計算相對定量比值。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(Western blot)

細胞收集后加入RIPA裂解液(1×PBS,1%NP40，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA，0.5%去氧膽酸鈉，1 mmol/L原釩酸鈉)常規(guī)方法提取細胞的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白質(zhì)，行10% SDS-PAGE電泳。電泳完畢后，4 ℃、90 V電轉(zhuǎn)移2 h至PVDF膜上。PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h后，加入一抗4 ℃溫育過夜，洗膜后，加入二抗室溫溫育1.5 h，洗膜后，加入現(xiàn)配的增強型化學發(fā)光試劑(ECL)常規(guī)顯像。以β-actin為內(nèi)對照。

1.2.4 CCL28逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建

CCL28帶有SalI(GTCGAC)和BamHI(GGATCC)酶切位點的引物(384bp)：上游5’-TATGGATCCATGCAGCAGAGAGGACTC GCCAT-3’；下游5’- CGCGTCGACCTAATAAG GAGTTTTATGGCCGTA-3’。以人乳腺癌細胞系T47D為模板得到PCR產(chǎn)物，反應(yīng)產(chǎn)物為5’端帶有SalⅠ位點，3’端帶有BamHⅠ位點的目的基因片段。PCR反應(yīng)條件同上。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，按Qiagen膠回收試劑盒操作回收片段。將PCR產(chǎn)物和pBabe逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行SalⅠ和BamHⅠ雙酶切，T4連接酶進行連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆擴增抽提質(zhì)粒。對重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabe-CCL28進行雙酶切鑒定。將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabe和重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBabe-CCL28利用磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染Phoenix細胞，加入Polybrene增加病毒包裝的效果，轉(zhuǎn)染后48 h收獲含病毒的上清液，5 030×g，離心5 min，去除細胞沉淀，0.45 μm的濾膜過濾，將上清液分裝，-80 ℃保存。

1.2.5 CCL28過表達細胞株的建立及鑒定

利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染乳腺癌細胞株MDAMB-231，感染48 h后加入含有puromycin的培養(yǎng)基進行藥物篩選，獲得抗性克隆，擴大培養(yǎng)，利用熒光定量PCR方法鑒定過表達效果，命名為MDA-MB-231/CCL28，空載體克隆命名為MDA-MB-231/vector。

1.2.6 CCK8法測細胞增殖

MDA-MB-231細胞使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基；取2 500個/孔(100 μL/孔)的濃度將處于對數(shù)期的細胞接種到96孔板，每孔設(shè)3個對照；待細胞貼壁后，加入10 μL CCK8，溫育2 h；用自動酶標儀在450 nm波長處，測定各孔的A值。連測7 d，最后取各樣本的平均值進行比較。

1.2.7 軟瓊脂克隆形成實驗

稱取軟瓊脂粉末配制成1.4%及0.7%濃度的軟瓊脂，高壓滅菌，放37 ℃溫箱不凝固；按1∶1比例使1.4%軟瓊脂與2×DMEM混合，取4 mL注入6 cm培養(yǎng)皿中，冷卻凝固；制備細胞懸液，用一般傳代方法將對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞分散成單細胞懸液，計數(shù)；將細胞調(diào)至20 000個細胞，加入2×DMEM至500μL，與0.7%軟瓊脂500μL混合，鋪入鋪有凝膠的皿中，待凝固后放溫箱培育10～14 d；倒置顯微鏡下計數(shù)。

1.2.8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

按常規(guī)方法消化、離心(1 509×g)MDAMB-231/CCL28和MDA-MB-231/vector細胞，計數(shù)，將細胞調(diào)至2×105個，經(jīng)Annexin-V、FITC染色后，利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗；計量資料采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 建立穩(wěn)定的CCL28過表達的乳腺癌細胞株

將設(shè)計好的CCL28引物片段在人的基因組數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)進行比對，未發(fā)現(xiàn)與其他編碼序列同源。隨后將構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄過表達載體進行測序分析，選取序列正確的載體進行下一步的實驗。經(jīng)包裝細胞Phoenix包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒，與培養(yǎng)基按比例稀釋，并設(shè)立空白對照，用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MDAMB-231細胞，感染后48 h加入含嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行藥物篩選，14 d后建立抗性克隆，將克隆擴大培養(yǎng)，收集細胞進行感染效果的檢測。半定量RT-PCR、熒光定量PCR和Western blot檢測結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)入CCL28 cDNA的細胞(MDAMB-231/CCL28)較轉(zhuǎn)入空載體(MDA-MB-231/ vector)中CCL28的表達明顯上調(diào)(圖1)。

圖1 半定量PCR、實時熒光定量PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染后CCL28 mRNA表達和蛋白水平Fig.1 CCL28 mRNA expression and protein level in MDA-MB-231/CCL28 detected by semi-quantitative PCR (A), real-time PCR (B) and Western blot (C)

2.2 過表達CCL28促進乳腺癌細胞MDAMB-231增殖

為了研究CCL28對MDA-MB-231細胞增殖能力的影響，本研究采用CCK8法測定了細胞培養(yǎng)24、48、72、96、120、144和168 h后的吸光度值(A)，以每日吸光度值均數(shù)繪制了各組細胞的生長曲線。結(jié)果表明，過表達CCL28的MDAMB-231/CCL28乳腺癌細胞組的增殖能力明顯高于MDA-MB-231/vector組(P＜0.05，圖2)。

2.3 過表達CCL28促進乳腺癌細胞MDAMB-231克隆形成

軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明，CCL28能夠促進乳腺癌細胞MDA-MB-231在軟瓊脂中的克隆形成。顯微鏡下可見MDA-MB-231/CCL28形成的克隆比MDA-MB-231/vector中顯著增多；3次重復(fù)實驗的定量數(shù)據(jù)顯示，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3A、B)。

圖2 CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力Fig.2 The proliferative ability of MDA-MB-231 cells infected with different plasmids detected by CCK-8 method

圖3 軟瓊脂克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞克隆形成情況Fig.3 Anchorage-independent colony formation on soft agar in association with CCL28 protein expression

2.4 過表達CCL28抑制乳腺癌細胞MDAMB-231凋亡

為了分析CCL28對細胞凋亡的影響，本研究利用流式細胞術(shù)檢測MDA-MB-231/CCL28和MDA-MB-231/vector細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組細胞相比，過表達CCL28的MDAMB-231/CCL28細胞凋亡顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖4A)。

為了進一步分析CCL28與細胞凋亡的關(guān)系，本研究利用Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的變化，結(jié)果顯示，MDA-MB-231/CCL28中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯高于其對照組(圖4B)。

圖4 過表達CCL28抑制細胞凋亡Fig.4 Over-expression of CCL28 inhibits breast cancer cells apoptosis.

3 討 論

CCL28是CC族趨化因子家族中新的一員，可表達于不同的黏膜部位，包括唾液腺、乳腺、氣管及結(jié)腸等［4-5］。有研究表明，在促炎因子的刺激下，CCL28在結(jié)腸上皮細胞中的表達上調(diào)，提示CCL28與炎性反應(yīng)密切相關(guān)［6］。Eksteen等［7］的研究也證實了CCL28與炎性反應(yīng)的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)因子LPS或IL-1β能夠促使CCL28分泌增多，從而使得表面表達CCR10受體的T細胞募集到黏膜炎性反應(yīng)區(qū)域。Hieshima等［8］進一步闡述了CCL28在炎性反應(yīng)中的作用，即具有廣譜抗菌活性。目前，關(guān)于CCL28與腫瘤的關(guān)系研究較少。有研究表明，CCL28在人乳腺癌組織中的表達顯著低于其鄰近正常組織［9］。Dimberg等［10］檢測了76例結(jié)直腸癌患者組織和血清CCL28蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織CCL28蛋白的表達比正常組織中顯著降低(P＜0.001)，結(jié)腸癌患者血清中CCL28蛋白的表達遠高于直腸癌患者。最新研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可以使卵巢癌中CCL28的表達上調(diào)，進而募集表達有CCL28受體CCR3和(或)CCR10的Treg細胞到腫瘤部位，最終促進血管生成及免疫耐受，從而使得癌癥進展［11］。

為了研究CCL28基因過表達對乳腺癌細胞增殖能力的影響，本研究在構(gòu)建pBabe-CCL28表達載體后，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將CCL28基因整合到乳腺癌細胞MDA-MB-231中，經(jīng)嘌呤霉素篩選后克隆出高表達CCL28基因的乳腺癌細胞，命名為MDA-MB-231/CCL28，用于CCL28基因功能的研究。采用CCK-8法檢測細胞的生長能力時發(fā)現(xiàn)，CCL28過表達的MDA-MB-231/ CCL28組細胞生長能力較MDA-MB-231/vector空質(zhì)粒對照組明顯增強(P＜0.05)，提示CCL28在MDA-MB-231細胞的生長中起促進作用。軟瓊脂克隆形成實驗是一種檢測細胞克隆形成能力的方法，可以在一定程度上反映細胞在體內(nèi)的成瘤能力。本研究發(fā)現(xiàn)CCL28過表達后細胞的克隆形成能力顯著提高(P＜0.05)，提示其體內(nèi)成瘤能力也提高。本研究利用流式細胞儀檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231/CCL28組細胞凋亡較對照組明顯減少，提示CCL28能夠抑制MDA-MB-231細胞凋亡。Bcl-2基因是一種重要的凋亡調(diào)控基因，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及細胞凋亡方面起重要的作用，其過度表達可抑制細胞的凋亡，延長細胞壽命，促進細胞生存［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞系MDAMB-231過表達CCL28后Bcl-2表達量上調(diào)，這可能是CCL28抑制細胞凋亡的重要機制之一，其詳細機制有待進一步的研究。

綜上所述，CCL28能夠促進乳腺癌細胞增殖，并抑制乳腺癌細胞凋亡。CCL28抑制乳腺癌細胞凋亡的能力，有可能與上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達相關(guān)。雖然CCL28的功能、分子機制和信號轉(zhuǎn)導通路尚待深入研究，但體外促癌作用提示CCL28有可能成為治療乳腺癌的潛在靶分子。

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Over-expression of chemokine CCL28 promotes the proliferation ability of human breast cancer cells

LIN Feng-juan, YANG Xiao-li, GUO Ya-jie, SHAO Zhi-min, OU Zhou-luo (Breast Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

OU Zhou-luo E-mail: ouzhouluo@yahoo.com.cn

Background and purpose: CCL28, also known as mucosa-associated epithelial chemokine (MEC), is a member of the CC subfamily. Studies have shown that CCL28 is associated with tumor progress. However, little is known about its function in breast cancer. In this study, we construct the expression vector of cDNA encoding CCL28 gene and observe its effects on cell growth ability of human breast cancer cell line MDA-MB-231 in vitro. Methods: The pBabe-CCL28 expression vector was constructed, then transfected into Phoenix cells and used to infect cultured breast cancer cells MDA-MB-231 by using retroviruses infection method. The positive clones were selected with puromycin to establish stable transfectants MDA-MB-231/CCL28. Control cell lines were generated by infection with viruses containing empty vector by following the same protocol. CCL28 mRNA and protein in MDA-MB-231/ CCL28 were determined by semi-quantitative RT-PCR, realtime PCR and western blot respectively. Cell proliferation was tested by cell counting kit 8 (CCK8). Cell apoptosis percentage was observed by flow cytometry. The ability of colony formation was tested by soft agar. The expression of apoptosis associated protein was measured by Western blot. Results: The cell line MDA-MB-231/CCL28 stabling expresses chemokine CCL28 was successfully constructed. In the MDA-MB-231/CCL28 cells, cell proliferation was increased, and cell apoptosis percentage was decreased. Westernblot showed that the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was decreased. Conclusion: Our data provides strong evidence that overexpression of CCL28 can promote the proliferative ability of MDA-MB-231 and inhibit the cell apoptosis, which may be regulated by Bcl-2. Therefore, CCL28 could be a important target for the treatment of breast cancer.

Breast cancer; Chemokine; CCL28; Gene expression; Proliferation

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.001

R737.9

：A

：1007-3639(2013)03-0161-06

2012-12-30

2013-02-20）

國家自然科學基金資助項目(No：30570695，81172506)；上海市乳腺腫瘤重點實驗室資助項目(No：12DZ2260100)。

歐周羅 E-mail:ouzhouluo@yahoo.com.cn