周 勇 文芳杰

貴州省黔南布依族苗族自治州中醫(yī)醫(yī)院，貴州 都勻 558000

鹿角壯骨膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

周 勇 文芳杰

貴州省黔南布依族苗族自治州中醫(yī)醫(yī)院，貴州 都勻 558000

目的：鹿角壯骨膠囊為黔南州中醫(yī)醫(yī)院“骨傷Ⅲ”號(hào)驗(yàn)方，根據(jù)醫(yī)院制劑的注冊(cè)要求，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。方法：采用薄層色譜法定性鑒別處方中臣藥炙黃芪和佐藥川芎；采用高效液相色譜法測(cè)定骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量。結(jié)果：炙黃芪、川芎能定性鑒別出，陰性無干擾；柚皮苷的回歸方程分別為Y＝1745.5X＋31.35，r＝0.9998，膠囊中柚皮苷含量為0.036～0.052%。結(jié)論：該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)檢測(cè)方法正確、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，對(duì)于控制和評(píng)價(jià)鹿角壯骨膠囊的品質(zhì)有重要意義。

鹿角壯骨膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；柚皮苷

鹿角壯骨膠囊處方為黔南州中醫(yī)醫(yī)院老中醫(yī)豐仕多年的臨床實(shí)踐總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)方。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，方中鹿角霜具溫腎助陽、收斂止血之功，為君藥；枸杞子、黃芪、自然銅共為臣藥，協(xié)助君藥補(bǔ)腎益氣，接骨續(xù)筋；熟地黃、骨碎補(bǔ)、白術(shù)、川芎四藥共為佐藥，佐助君、臣藥，補(bǔ)腎填髓，養(yǎng)血和肝，益氣續(xù)筋之功。諸藥合用，共奏補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)筋壯骨之功效。適用于骨折肝腎虧虛證，癥見骨連未堅(jiān)，腰膝酸軟，肢體萎軟，神疲乏力，舌質(zhì)紅、苔薄白，脈細(xì)。此方在臨床療效好。根據(jù)臨床需要和劑型選擇依據(jù)將原湯劑改進(jìn)為硬膠囊劑，提高患者應(yīng)用的順應(yīng)性，以更好的服務(wù)于廣大患者。本文在劑型改進(jìn)的基礎(chǔ)上，采用中試穩(wěn)定的鹿角壯骨膠囊進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為鹿角壯骨膠囊醫(yī)院制劑的注冊(cè)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent12000高效液相色譜儀；Agilent－G1311A四元泵；Agilent-G1322A真空脫氣器；Agilent－G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；CHEMSTATION B.04.02化學(xué)工作站；AT－330柱溫箱（天津奧特賽恩斯科學(xué)儀器有限公司）；超聲清洗機(jī)（無錫超聲電子設(shè)備廠）；電子天平（瑞士Mettler公司）；KQ－250B型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器公司）；

鹿角壯骨膠囊，黔南州中醫(yī)醫(yī)院制劑室自制；柚皮苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110722－201111）；阿魏酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110773－200611）；黃芪甲苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0781－200210）。甲醇為色譜純，水為純凈水；其它試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 川芎的薄層鑒別 取本品4g，加1%碳酸氫鈉溶液50mL，超聲處理30min，離心，取上清液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用乙醚提取3次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。按處方及膠囊制備工藝制作缺川芎膠囊，稱取4g，同法制得陰性對(duì)照樣品。另取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸（4：1：0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照樣品在在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

2.2 炙黃芪薄層鑒別 取本品5g，加甲醇50mL，回流提取1.5h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇液；用氨試液洗滌兩次，每次20mL，棄去洗液，再用正丁醇飽和的水洗至中性，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解；通過D101大孔吸附樹脂柱層析，以水50mL洗脫，棄去水液，再以30%乙醇50mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。按處方及膠囊制備工藝制作缺川芎膠囊，稱取4g，同法制得陰性對(duì)照樣品。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成1mg／mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯示相同顏色的斑點(diǎn)；紫外光燈（365nm）下顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照樣品在在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)與熒光斑點(diǎn)。見圖2、3。

3 柚皮苷含量測(cè)定

3.1 色譜條件 色譜柱為L(zhǎng)incrospher－C18（江蘇漢邦科技，250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇：醋酸：水＝35：4：65；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量10μL。

3.2 對(duì)照品純度檢查 在選定色譜條件分離后，按面積歸一化法，計(jì)算其含量為100%。

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性 在“3.1項(xiàng)”色譜條件下，柚皮苷和樣品中其它組分色譜峰可基線分離，按柚皮苷峰計(jì)算，理論板數(shù)為4177。同時(shí)取陰性供試品溶液進(jìn)樣，結(jié)果表明，陰性供試品在柚皮苷色譜峰處無相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)。柚皮苷、樣品及陰性供試品的HPLC圖譜見圖4。

3.4 對(duì)照品溶液的制備 取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1mL含100μg的溶液，即得0.1mg／mL。

3.5 供試品溶液的制備 提取時(shí)間的考察：取鹿角壯骨膠囊（批號(hào)為1204231）約3.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱重，分別超聲處理不同時(shí)間，放冷后，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按上述條件測(cè)定，結(jié)果表明：處理20min，柚皮苷含量基本不再增加，為保證提取完全，故確定超聲處理時(shí)間為30min。

3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液（0.1mg／mL）2、4、6、8、10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，柚皮苷進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，得回歸方程為：Y＝1745.55X＋31.35，r＝0.9998。結(jié)果表明：柚皮苷進(jìn)樣量在0.2－1.0μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

3.7 精密度考察 分別精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液（0.1mg／mL）5μL，按上述色譜件重復(fù)進(jìn)樣6次，柚皮苷峰面積積分值的RSD＜2%。結(jié)果表明：精密度良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取供試品溶液（批號(hào)1204231）10μL，于0、1、2、4、8h分別進(jìn)樣，測(cè)得柚皮苷峰面積積分值，RSD為0.12%。結(jié)果表明：供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。1個(gè)月后，取鹿角壯骨膠囊（批號(hào)1204231）約3.0g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成供試液，進(jìn)樣10μL，測(cè)得峰面積積分值并計(jì)算含量，0月平均含量為0.048%，1個(gè)月后平均含量為0.050%。結(jié)果表明：樣品在1個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取鹿角壯骨膠囊（批號(hào)1204231）約3.0g，精密稱定6份，按供試品溶液的制備方法制成供試液，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)得峰面積積分值并計(jì)算含量，含量平均為0.048%，RSD值為1.73%，試驗(yàn)結(jié)果表明：重復(fù)性試驗(yàn)良好。

3.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（批號(hào)1204231）1.5g，精密稱定，分別加入柚皮苷對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法制備加樣回收供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定，結(jié)果見下表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明：回收率在96～100%之間，加樣回收良好。

3.11 樣品測(cè)定 取樣品約3.0g，精密稱定，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果鹿角壯骨膠囊中柚皮苷的含量為0.036－0.052%，結(jié)果見下表。

樣品測(cè)定結(jié)果

批號(hào)樣品重（g）柚皮苷含量（%）平均值（%）201200173.02630.051 3.00120.0520.052

4 討論

鹿角壯骨膠囊在臨床應(yīng)用中收到了較好的療效，一直沿用至今。原為湯劑煎服，服用、攜帶不方便，不宜大量制備。根據(jù)臨床需要改進(jìn)劑型為硬膠囊劑。劑型改進(jìn)后為了保證其原有臨床療效，需制定相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文薄層定性鑒別為鑒定鹿角壯骨膠囊是否按方投料生產(chǎn)提供相關(guān)鑒定方法；柚皮苷含量為0.036～0.052%，考慮到不同批次含量的差異，暫定本品每1g含骨碎補(bǔ)以柚皮（C27H32O14）計(jì)，不得少于0.20mg。本文質(zhì)量研究方法對(duì)鹿角壯骨膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定具有一定意義。

炙黃芪鑒別參考《中華人民共和國藥典》2010年版一部“黃芪”藥材的鑒別，以黃芪甲苷為對(duì)照品，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）的下層溶液為展開劑，但由于是復(fù)方，其它成分干擾大，導(dǎo)致其它成分的斑點(diǎn)與炙黃芪相重疊，影響其分離度，故對(duì)前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，通過D101大孔吸附樹脂處理，選擇合適濃度的洗脫劑，可使樣品純化，有效除去其它雜質(zhì)成分對(duì)黃芪甲苷的干擾。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：38、239、285.

［2］林昱，李新田，求財(cái)榮，等.芪參富康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，2008，30（9）：26－27.

［3］鄒俊，張玉潔，田宏，等.川芎茶調(diào)丸（濃縮丸）的薄層色譜鑒別［J］.中國藥師，2002，5（8）：505－506.

R286.0

A

1007－8517（2013）16－0020－03

2013.06.17）