曹雁行 孫玉江 張志鵬 鄒敬清 潘慶杰

（①山東省東營市畜牧局 257091 ②青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 青島③東營職業(yè)學(xué)院 山東 東營 ④青島德瑞駿發(fā)生物有限公司 山東 青島）

馬人工授精技術(shù)試驗

曹雁行①孫玉江②③張志鵬④鄒敬清④潘慶杰②*

（①山東省東營市畜牧局 257091 ②青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 山東 青島③東營職業(yè)學(xué)院 山東 東營 ④青島德瑞駿發(fā)生物有限公司 山東 青島）

為加快本地馬品種改良采用馬人工授精技術(shù)(AI)。結(jié)果表明，Selle Francais公馬射精量為118.2±14.53ml，精子密度2.01±0.06億/ml；常溫下，精液稀釋液A在1、2h內(nèi)存活率分別為0.75±0.02、0.4±0.04，與進(jìn)口的INRA96精液稀差異不顯著(P＞0.05)；保鮮精液低溫(0～5℃)保存48h，受精成功率為61.53%，保鮮精液48h后效果較差。鮮精、保鮮精液和冷凍精液的人工授精成功率分別為80.95%、61.5%、45.5%，差異均極顯著(P＜0.01)。

馬 人工授精 保鮮精液 冷凍精液

人工授精在我國應(yīng)用始于上世紀(jì)三十年代，具有提高種畜利用率、減少飼養(yǎng)成本、控制疾病傳播、加速品種改良等優(yōu)點，曾為我國馬的育種和新品種的培育起到重要作用。進(jìn)入二十一世紀(jì)以來，現(xiàn)代馬業(yè)迅速發(fā)展，進(jìn)口馬匹數(shù)量不斷增加，人工授精、胚胎移植等新技術(shù)研究、開發(fā)與推廣工作也同步發(fā)展，加快了優(yōu)良馬品種的繁育。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 Selle Francais(塞拉-法蘭西)馬、蒙古馬、伊犁馬。

1.1.2 設(shè)備試劑 主要設(shè)備有醫(yī)用超聲波清洗器、體視顯微鏡、冷凍儀、獸用B超儀、精子密度儀、高速冷凍離心機等。主要試劑有丙酮酸鈉、Na2HPO4、KH2PO4、甘氨酸、D-無水葡萄糖、D-果糖、a-乳糖、進(jìn)口精液稀釋液等。

1.2 方法

1.2.1 采精 采用自行設(shè)計假臺畜(專利號：201220037887.8)，按照《動物繁殖學(xué)[1]》進(jìn)行采精、檢測、輸精、保鮮、冷凍，并統(tǒng)計采精量、精子活力、精子密度和授精成功率等。

1.2.2 精液稀釋 參照動物精液稀釋液的成分與組成[2-5]，設(shè)計了4個精液稀釋液試驗組，標(biāo)記為稀釋液A、B、C和D，分別在低溫、常溫下保存并鏡檢。

1.2.3 保鮮精液 根據(jù)精子密度和活率計算保鮮精液量。按照精子數(shù)不低于1×108[1]確定稀釋比例，制作的保鮮精液量為10ml/份。

1.2.4 冷凍精液 精液與稀釋液按1:3的比例進(jìn)行稀釋，稀釋后檢測精子活率高于50%。參照其家畜的冷凍精液制備方法[6]制作凍精細(xì)管。試驗結(jié)果用excel、SPSS軟件處理，ANOVA和Tukey分析，每次試驗至少重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 精液品質(zhì)鑒定

選取4匹Selle Francais公馬的精液品質(zhì)進(jìn)行鑒定，從采精量、精子活率、精子密度等方面進(jìn)行檢測(表1)。

表1 公馬精子質(zhì)量檢測結(jié)果 (ml、億/ml、%)

從射精量看，Ⅲ號公馬的精液量(133±26.3)高于I號、II號和IV號(P＜0.01)。從精子活率看，III號公馬的精子活率(0.67±0.12)低于I號、II號和IV號(P＜0.01)。從精子密度看，III號公馬的精子密度(0.75億/ml)低于I號、II號和IV號(P＜0.01)。

3.2 人工授精時間

用I號、II號種公馬精液進(jìn)行105匹次輸精，成功率為80.95%(圖1)。人工授精情況顯示，受孕率最高月份在4月份，達(dá)到94.1%；8月份受孕率最低。

圖1 人工授精匹次數(shù)與受精成功率

3.3 精液稀釋液

對精子在稀釋液A、B、C和D常溫(15～25℃)保存0、0.5、1、2和4h后，精子活率的變化情況進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果表明，常溫保存下，稀釋液A(發(fā)明專利號：20121002639 3.4)效果較好，精子在1、2h內(nèi)活率分別為0.75±0.02、0.4± 0.04，與進(jìn)口的INRA96精液稀差異不顯著(P＞0.05)。釋液稀釋液B、C和D，精子活率下降比較快，與稀釋液A差異顯著。

表2 不同精液稀釋液常溫保存(15～25℃)馬精子活率 （%）

保鮮精液低溫(0～5℃)保存到48h后，精子存活比例達(dá)到58.7%；72h后，精子活力降到39.1%；96h后，精子活力降至21.6%。利用保鮮精液進(jìn)行26匹次的授精試驗，16匹次受孕成功，48h之內(nèi)的受精成功率達(dá)到61.53%(圖2)。

圖2 保鮮精液精子存活比例與受精成功率

A圖表示精液在低溫保存12、24、48、72和96h后精子存活比例；B圖表示精液在低溫保存12、24、48、72和96h后人工授精的成功率。

3.4 冷凍精液 精液冷凍保存12、24、48、72、96、120和240h后，解凍并檢查精子活率(如圖8)，精液冷凍保存72h、120和480h后，精子解凍后活率分別達(dá)59.3%、58.7%和57.3%，活率保持在55%以上。對鮮精、保鮮精液和冷凍精液的人工授精成功率的比較表明，人工授精成功率分別達(dá)到80.95%、61.5%、45.5%。

圖3 冷凍精液精子存活比例與受精成功率

圖3 表示冷凍精液的精子存活比例與人工授精成功率。A圖表示精液在冷凍保存12、24、48、72、96、120和480 h后，精子存活比例；B圖表示鮮精、保鮮精液和冷凍精液的人工授精成功率比較。

4 討論與結(jié)論

4.1 精液采集

作為種公馬必須要保持遺傳性能穩(wěn)定[7]，生產(chǎn)性能優(yōu)良，系譜清楚，檢疫合格，這是開展人工受精技術(shù)的基礎(chǔ)。因此，在做采精以前，首先對候選的種公馬進(jìn)行了初步選擇，確定4匹Selle Francais參加采精試驗。從精液檢測結(jié)果看，Ⅲ號公馬精液質(zhì)量不穩(wěn)定，頂體完整率較低，可能與年齡低(3歲)有關(guān)，因此，Ⅲ號公馬暫不做為種用。其它3匹種用順序為依次為I號、II號、Ⅳ號。

4.2 人工授精時間

影響人工授精效果的因素很多，馬匹年齡、健康狀況、精液質(zhì)量、環(huán)境溫度及輸精技術(shù)等，馬自身生理周期變化是內(nèi)因。本試驗表明，青島地區(qū)馬3～9月均可以發(fā)情，以5月最為集中，這也符合季節(jié)性發(fā)情動物的一般規(guī)律，即由短日照變最長日照時，公馬精液量最大，母馬開始發(fā)情；由最長日照逐漸變短日照時，公馬精液量減少，母馬一般不再發(fā)情。人工授精的效果與季節(jié)、母馬發(fā)情周期變化密切相關(guān)。因此，青島地區(qū)要抓住4～7月發(fā)情季節(jié)，盡早完成配種任務(wù)。

4.3 精液稀釋液

稀釋液是精子的保護(hù)劑，可以有效減緩精子運動、抑制精子代謝、延長精液保存時間。一般稀釋液中都含有營養(yǎng)物質(zhì)、緩沖劑、抗氧化物質(zhì)、酶、抗菌素及微量元素等，稀釋液成分、各成分的濃度及組分之間的比例都對精液保存質(zhì)量有重要影響(徐振軍等，2009)。常溫保存(15～25℃)下，以牛奶、葡萄糖、棉子糖等為主要成分的稀釋液A與法國進(jìn)口產(chǎn)品其效果無顯著差異。雖然對于INRA96的具體成分我們不清楚，但葡萄糖、棉子糖等可以提高精子活力，調(diào)節(jié)精液滲透壓，以此延長精液的保存時間。

4.4 冷凍精液

冷凍精液的制作實現(xiàn)了優(yōu)良種畜遺傳資源的長期保存，目前，牛的冷凍精液保存期已經(jīng)達(dá)到40年[8-10]。試驗表明，短時間(0-6h)來看，隨著時間的推移，精子活力也隨之降低；但是長時間(6h以上)看，活率基本保持在55%以上。對鮮精、保鮮精液和冷凍精液的人工授精成功率的比較表明，如果條件許可，盡量不要使用冷凍精液。本試驗采用0.5ml細(xì)管冷凍精液與0.25ml顆粒凍精進(jìn)行了比較，顯示同一稀釋液細(xì)管凍精在解凍后活率方面有明顯優(yōu)勢。

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S821.3+4

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1007-1733(2013)09-0011-03

2013–07–25）

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