丁如賢 李 霞 李一珺 孫雪妹 楊明華

（上海市浦東食品藥品檢驗(yàn)所，上海，201203）

黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷含量測(cè)定方法的改進(jìn)

丁如賢 李 霞 李一珺 孫雪妹 楊明華

（上海市浦東食品藥品檢驗(yàn)所，上海，201203）

目的：建立操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好的黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷的提取及含量測(cè)定方法。方法：比較4種不同的提取方法，用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪甲苷含量，色譜柱為Capcell PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32∶68）。結(jié)果：簡(jiǎn)化的提取方法，黃芪甲苷的進(jìn)樣量在0.53～12.72 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 4），平均回收率為98.91%，RSD＝2.10%。結(jié)論：改進(jìn)方法樣品提取簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷含量測(cè)定方法。

黃芪；黃芪甲苷；含量測(cè)定；高效液相蒸發(fā)光檢測(cè)

黃芪為常用中藥，是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒等功效。黃芪中主要成分為皂苷類、黃酮類、多糖類等，其中黃芪甲苷具有正性肌力保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、抗病毒等多方面藥理活性［1］，是黃芪藥材中的重要活性成分，通常作為黃芪藥材及其制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。

中華人民共和國(guó)藥典（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2010年版［2］采用HPLC-ELSD測(cè)定黃芪中黃芪甲苷的含量，樣品前處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)、影響因素多，直接導(dǎo)致方法的回收率較低、重現(xiàn)性較差，對(duì)處于合格邊緣檢測(cè)樣品的準(zhǔn)確判斷有非常大的困難。有些文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道的方法與藥典基本類似，定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性較差。也有文獻(xiàn)［5-6］報(bào)道對(duì)樣品前處理進(jìn)行簡(jiǎn)化，僅采用超聲處理，然后用HPLC-ELSD梯度洗脫的方法測(cè)定藥材中黃芪甲苷的含量，但檢測(cè)結(jié)果也不理想。

我們建立了黃芪樣品的處理方法，簡(jiǎn)化了樣品的制備過(guò)程，縮短前處理時(shí)間和步驟，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2424 ELS檢測(cè)器，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站；BOLONG USC-702超聲波清洗器；D101大孔吸附樹脂柱（柱內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm）。

黃芪飲片（上海虹橋中藥飲片有限公司，批號(hào)：20110614）；黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110781-200613）。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），冰醋酸（分析純），水（超純水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Capcell PAK C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（32∶68）；柱溫：30℃；流速：1 mL／min；Waters 2424 ELS檢測(cè)條件：增益60，漂移管溫度65℃，氮?dú)鈮毫?0Psi，霧化器溫度39℃。

2.2 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取在放置五氧化二磷的減壓干燥器中干燥24 h黃芪甲苷對(duì)照品10.60 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含黃芪甲苷0.53 mg）。

2.2.2 供試品溶液制備 將黃芪飲片粉碎，備用。

方法（a）（2010版《中國(guó)藥典》方法）供試品制備：取本品粉末約4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過(guò)夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)訜崴?0 mL，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和的正丁醇提4次，每次40 mL，合并正丁醇液，氨試液洗2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷，通過(guò)D101大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

方法（b）供試品制備：與方法（a）同至“正丁醇液蒸干”，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

方法（c）供試品制備：取本品粉末約4 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇60 mL，冷浸過(guò)夜，加熱回流1.5 h，靜置5 min，收集上清液，殘?jiān)蛹状?0 mL，超聲5 min，靜置5 min，收集上清液，重復(fù)以上步驟3次，合并上清液，回收溶劑并濃縮至干，從“殘?jiān)铀?0 mL”開始，與方法（a）相同。

方法（d）供試品制備：取本品粉末約4 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇60 mL，冷浸過(guò)夜，加熱回流1.5 h，靜置5 min，收集上清液，殘?jiān)蛹状?0 mL，超聲5 min，靜置5 min，收集上清液，重復(fù)以上步驟3次，合并上清液，回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)訜崴?0 mL，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和正丁醇提4次，每次50 mL，合并正丁醇液，氨試液洗2次，每次50 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取0.53 mg／mL黃芪甲苷對(duì)照品溶液1、3、9、15、21、24 μL注入Waters 2 695，按照上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得回歸方程Y＝1.4848974 X+5.062 740，r＝0.999 4，表明黃芪甲苷在0.53～12.72 μg時(shí)進(jìn)樣量對(duì)數(shù)與峰面積對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL注入Waters 2 695，測(cè)定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果RSD為2.17%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.53 mg／mL黃芪甲苷的對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃芪甲苷的峰面積，計(jì)算，結(jié)果其RSD為0.87%。

圖1 黃芪HPLC-ELSD色譜圖：A黃芪甲苷對(duì)照品；B空白；C 2010版藥典方法；D改進(jìn)方法（d）

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品5份（批號(hào)：20110614，1.052 mg·g-1），每份約4 g，分別精密加入0.53 mg／mL黃芪甲苷對(duì)照品2 mL，按供試品溶液制備方法（d）及測(cè)定法操作，進(jìn)行色譜分析，得平均回收率為98.91%，RSD為2.10%。結(jié)果見表1。

2.7 樣品測(cè)定 取同一批號(hào)黃芪飲片，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，計(jì)算樣品中黃芪甲苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中黃芪甲苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

1）潘細(xì)貴［7］已證明，在黃芪供試品制備中D101型大孔樹脂吸附除雜步驟即使低濃度的乙醇（15%）也能洗脫出一定量的黃芪總皂苷，并隨著濃度的增大而增加，同時(shí)D101型大孔吸附樹脂對(duì)黃芪總皂苷有一定的吸附量。2010版《中國(guó)藥典》大孔樹脂吸附除雜步驟是用40%乙醇30 mL洗脫，所以此方法將洗脫出較多的黃芪總皂苷。實(shí)驗(yàn)表明，省去大孔樹脂吸附除雜這一步，對(duì)黃芪甲苷峰的分離及檢測(cè)沒有任何影響，同時(shí)可大幅提高所測(cè)樣品濃度，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。2）結(jié)果表明，索氏提取法與加熱回流提取法有一定差異，回流提取法提取量稍高。3）樣品中黃芪甲苷的含量測(cè)定結(jié)果的RSD是：方法a＞c＞b＞d。從其結(jié)果可以看出現(xiàn)行的2010版《中國(guó)藥典》由于處理方法的繁瑣、步驟多以及其他一些因素的影響，含量測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較差。因此我們建議改用具有更好穩(wěn)定性、重現(xiàn)性的方法（d）。4）《中國(guó)藥典》要求黃芪甲苷含量0.040%。本實(shí)驗(yàn)采用的改進(jìn)方法（d）所測(cè)含量高于標(biāo)準(zhǔn)一倍多，而按《中國(guó)藥典》方法測(cè)定，稍高于標(biāo)準(zhǔn)要求。筆者認(rèn)為，應(yīng)該改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，提高含量標(biāo)準(zhǔn)。5）同《中國(guó)藥典》采用的方法相比，改進(jìn)后的方法，樣品提取操作簡(jiǎn)單、方便省時(shí)、環(huán)保、節(jié)約能源與試劑，符合藥品檢測(cè)所要求的簡(jiǎn)單、方便、高效、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的科學(xué)檢測(cè)理念。可作為黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷質(zhì)量的檢測(cè)方法。6）許多投料黃芪的中成藥［8-15］，在標(biāo)準(zhǔn)制定黃芪甲苷含量檢測(cè)時(shí)都按照黃芪藥材和飲片的方法來(lái)處理。所以本實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)方法也可為許多中成藥中黃芪甲苷質(zhì)量的檢測(cè)提供理論依據(jù)。

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（2012-11-26收稿）

Improved Method for Determination of Astragaloside in Astragali Radix

Ding Ruxian，Li Xia，Li Yijun，Sun Xuemei，Yang Minghua
（Shanghai Pudong Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Objective：To establish a simple and reproducible method for determination of astragaloside in Astragali Radix.Methods：Four extraction methods were used and compared.The content of astragaloside was determined by HPLC-ELSD with a Capcell PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 um）and a mobile phase of acetonitrile-water（32：68）.Results：Using the simple extraction method，the linear relation was good with the range of 0.53～12.72 ug（r＝0.999 4）.The average recovery was 98.91%with RSD＝2.10%.Conclusion：The improved method is simple，accurate，and reproducible and can be used for the determination of astragaloside in Astragali Radix.

Astragali Radix；Astragaloside；Determination；HPLC-ELSD

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.06.028

丁如賢，Tel：021-51320025，E-mail：ruxianding＠hotmail.com