丁如賢 李 霞 李一珺 孫雪妹 楊明華

（上海市浦東食品藥品檢驗(yàn)所，上海，201203）

黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷含量測定方法的改進(jìn)

丁如賢 李 霞 李一珺 孫雪妹 楊明華

（上海市浦東食品藥品檢驗(yàn)所，上海，201203）

目的：建立操作簡便、重現(xiàn)性好的黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷的提取及含量測定方法。方法：比較4種不同的提取方法，用HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷含量，色譜柱為Capcell PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（32∶68）。結(jié)果：簡化的提取方法，黃芪甲苷的進(jìn)樣量在0.53～12.72 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 4），平均回收率為98.91%，RSD＝2.10%。結(jié)論：改進(jìn)方法樣品提取簡單、方便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷含量測定方法。

黃芪；黃芪甲苷；含量測定；高效液相蒸發(fā)光檢測

黃芪為常用中藥，是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒等功效。黃芪中主要成分為皂苷類、黃酮類、多糖類等，其中黃芪甲苷具有正性肌力保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、抗病毒等多方面藥理活性［1］，是黃芪藥材中的重要活性成分，通常作為黃芪藥材及其制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。

中華人民共和國藥典（以下簡稱《中國藥典》）2010年版［2］采用HPLC-ELSD測定黃芪中黃芪甲苷的含量，樣品前處理過程繁瑣、耗時、影響因素多，直接導(dǎo)致方法的回收率較低、重現(xiàn)性較差，對處于合格邊緣檢測樣品的準(zhǔn)確判斷有非常大的困難。有些文獻(xiàn)［3-4］報道的方法與藥典基本類似，定量檢測的準(zhǔn)確性較差。也有文獻(xiàn)［5-6］報道對樣品前處理進(jìn)行簡化，僅采用超聲處理，然后用HPLC-ELSD梯度洗脫的方法測定藥材中黃芪甲苷的含量，但檢測結(jié)果也不理想。

我們建立了黃芪樣品的處理方法，簡化了樣品的制備過程，縮短前處理時間和步驟，提高了測定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2424 ELS檢測器，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站；BOLONG USC-702超聲波清洗器；D101大孔吸附樹脂柱（柱內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm）。

黃芪飲片（上海虹橋中藥飲片有限公司，批號：20110614）；黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-200613）。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），冰醋酸（分析純），水（超純水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Capcell PAK C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（32∶68）；柱溫：30℃；流速：1 mL／min；Waters 2424 ELS檢測條件：增益60，漂移管溫度65℃，氮?dú)鈮毫?0Psi，霧化器溫度39℃。

2.2 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取在放置五氧化二磷的減壓干燥器中干燥24 h黃芪甲苷對照品10.60 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含黃芪甲苷0.53 mg）。

2.2.2 供試品溶液制備 將黃芪飲片粉碎，備用。

方法（a）（2010版《中國藥典》方法）供試品制備：取本品粉末約4 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加熱水10 mL，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和的正丁醇提4次，每次40 mL，合并正丁醇液，氨試液洗2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

方法（b）供試品制備：與方法（a）同至“正丁醇液蒸干”，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

方法（c）供試品制備：取本品粉末約4 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇60 mL，冷浸過夜，加熱回流1.5 h，靜置5 min，收集上清液，殘渣加甲醇40 mL，超聲5 min，靜置5 min，收集上清液，重復(fù)以上步驟3次，合并上清液，回收溶劑并濃縮至干，從“殘渣加水10 mL”開始，與方法（a）相同。

方法（d）供試品制備：取本品粉末約4 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇60 mL，冷浸過夜，加熱回流1.5 h，靜置5 min，收集上清液，殘渣加甲醇40 mL，超聲5 min，靜置5 min，收集上清液，重復(fù)以上步驟3次，合并上清液，回收溶劑并濃縮至干，殘渣加熱水10 mL，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和正丁醇提4次，每次50 mL，合并正丁醇液，氨試液洗2次，每次50 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取0.53 mg／mL黃芪甲苷對照品溶液1、3、9、15、21、24 μL注入Waters 2 695，按照上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以進(jìn)樣質(zhì)量對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積對數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得回歸方程Y＝1.4848974 X+5.062 740，r＝0.999 4，表明黃芪甲苷在0.53～12.72 μg時進(jìn)樣量對數(shù)與峰面積對數(shù)呈良好線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣10 μL注入Waters 2 695，測定黃芪甲苷峰面積，結(jié)果RSD為2.17%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.53 mg／mL黃芪甲苷的對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定黃芪甲苷的峰面積，計算，結(jié)果其RSD為0.87%。

圖1 黃芪HPLC-ELSD色譜圖：A黃芪甲苷對照品；B空白；C 2010版藥典方法；D改進(jìn)方法（d）

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品5份（批號：20110614，1.052 mg·g-1），每份約4 g，分別精密加入0.53 mg／mL黃芪甲苷對照品2 mL，按供試品溶液制備方法（d）及測定法操作，進(jìn)行色譜分析，得平均回收率為98.91%，RSD為2.10%。結(jié)果見表1。

2.7 樣品測定 取同一批號黃芪飲片，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，計算樣品中黃芪甲苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果

3 討論

1）潘細(xì)貴［7］已證明，在黃芪供試品制備中D101型大孔樹脂吸附除雜步驟即使低濃度的乙醇（15%）也能洗脫出一定量的黃芪總皂苷，并隨著濃度的增大而增加，同時D101型大孔吸附樹脂對黃芪總皂苷有一定的吸附量。2010版《中國藥典》大孔樹脂吸附除雜步驟是用40%乙醇30 mL洗脫，所以此方法將洗脫出較多的黃芪總皂苷。實(shí)驗(yàn)表明，省去大孔樹脂吸附除雜這一步，對黃芪甲苷峰的分離及檢測沒有任何影響，同時可大幅提高所測樣品濃度，提高了測定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。2）結(jié)果表明，索氏提取法與加熱回流提取法有一定差異，回流提取法提取量稍高。3）樣品中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果的RSD是：方法a＞c＞b＞d。從其結(jié)果可以看出現(xiàn)行的2010版《中國藥典》由于處理方法的繁瑣、步驟多以及其他一些因素的影響，含量測定結(jié)果的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較差。因此我們建議改用具有更好穩(wěn)定性、重現(xiàn)性的方法（d）。4）《中國藥典》要求黃芪甲苷含量0.040%。本實(shí)驗(yàn)采用的改進(jìn)方法（d）所測含量高于標(biāo)準(zhǔn)一倍多，而按《中國藥典》方法測定，稍高于標(biāo)準(zhǔn)要求。筆者認(rèn)為，應(yīng)該改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，提高含量標(biāo)準(zhǔn)。5）同《中國藥典》采用的方法相比，改進(jìn)后的方法，樣品提取操作簡單、方便省時、環(huán)保、節(jié)約能源與試劑，符合藥品檢測所要求的簡單、方便、高效、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的科學(xué)檢測理念?？勺鳛辄S芪藥材、飲片中黃芪甲苷質(zhì)量的檢測方法。6）許多投料黃芪的中成藥［8-15］，在標(biāo)準(zhǔn)制定黃芪甲苷含量檢測時都按照黃芪藥材和飲片的方法來處理。所以本實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)方法也可為許多中成藥中黃芪甲苷質(zhì)量的檢測提供理論依據(jù)。

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（2012-11-26收稿）

Improved Method for Determination of Astragaloside in Astragali Radix

Ding Ruxian，Li Xia，Li Yijun，Sun Xuemei，Yang Minghua
（Shanghai Pudong Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Objective：To establish a simple and reproducible method for determination of astragaloside in Astragali Radix.Methods：Four extraction methods were used and compared.The content of astragaloside was determined by HPLC-ELSD with a Capcell PAK C18（4.6 mm×250 mm，5 um）and a mobile phase of acetonitrile-water（32：68）.Results：Using the simple extraction method，the linear relation was good with the range of 0.53～12.72 ug（r＝0.999 4）.The average recovery was 98.91%with RSD＝2.10%.Conclusion：The improved method is simple，accurate，and reproducible and can be used for the determination of astragaloside in Astragali Radix.

Astragali Radix；Astragaloside；Determination；HPLC-ELSD

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.06.028

丁如賢，Tel：021-51320025，E-mail：ruxianding＠hotmail.com