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        化痰祛瘀疏肝法預(yù)防性干預(yù)對哮喘小鼠NGF-TrkA信號通路的影響

        2013-06-05 14:35:25張新光劉芳薛征李利清劉斐白莉虞堅爾
        世界中醫(yī)藥 2013年6期
        關(guān)鍵詞:平喘源性疏肝

        張新光劉 芳薛 征李利清劉 斐白 莉虞堅爾

        (1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院兒科,上海,200071;2上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)兒科研究所,上海,200071;3同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院兒科,上海,200120;4上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203)

        化痰祛瘀疏肝法預(yù)防性干預(yù)對哮喘小鼠NGF-TrkA信號通路的影響

        張新光1,2劉 芳3薛 征1,2李利清1,2劉 斐4白 莉1,2虞堅爾1,2

        (1上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院兒科,上海,200071;2上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)兒科研究所,上海,200071;3同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院兒科,上海,200120;4上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,201203)

        目的:探討化痰祛瘀疏肝法預(yù)防性干預(yù)對哮喘小鼠NGF-TrkA信號通路的影響。方法:以10%OVA/AL(OH)3致敏、5%OVA激發(fā)復(fù)制支氣管哮喘小鼠模型,于激發(fā)前開始給藥,至激發(fā)結(jié)束取材。用ELISA法檢測BALF中NGF、TrkA濃度,Wstern blot法檢測肺組織勻漿中NGF、TrkA蛋白表達。結(jié)果:模型組NGF、TrkA濃度明顯升高(P均<0.01),NGF、TrkA蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05,P<0.01);各處理組NGF、TrkA濃度均較模型明顯降低(P均<0.01),兩中藥組NGF蛋白表達均明顯低于模型組(P均<0.01),地米組與模型組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),兩中藥組TrkA蛋白表達均明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01);兩中藥組NGF、TrkA濃度下調(diào)不及地米組(P均<0.01);PCF組NGF、TrkA蛋白表達與地米組相似(P均>0.05),SGPCF組顯著優(yōu)于地米組(P均<0.05);兩中藥組NGF、TrkA濃度及蛋白表達均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論:在發(fā)作期干預(yù)方式下,化痰祛瘀疏肝法對哮喘小鼠升高的NGF、TrkA濃度及上調(diào)的NGF、TrkA蛋白表達均有降低作用,上述作用總體與化痰祛瘀平喘法相似,優(yōu)于地塞米松。提示化痰祛瘀疏肝法對哮喘小鼠神經(jīng)源性炎癥NGF-TrkA信號通路有較為確切的干預(yù)作用。

        哮喘/中醫(yī)藥療法;化痰祛瘀疏肝法;干預(yù)

        神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是一種多功能的細胞生長和調(diào)節(jié)因子,除對神經(jīng)系統(tǒng)的作用,尚對免疫、生殖、細胞增殖、造血等具有廣泛的作用[1-4]。NGF參與免疫炎癥調(diào)控以及復(fù)雜的神經(jīng)-免疫相互作用機制,可認為是神經(jīng)可塑性和免疫可塑性的雙重調(diào)控遞質(zhì)。支氣管哮喘免疫失衡及神經(jīng)源性炎癥兩大病理環(huán)節(jié)之間已被證明存在較為密切的關(guān)系,Th1/Th2免疫失衡可能通過調(diào)控NGF表達間接促進其誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥。

        化痰祛瘀平喘中藥在前期研究中經(jīng)動物實驗證明對哮喘小鼠Th1/Th2相關(guān)細胞因子的表達及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有調(diào)節(jié)作用,對氣道重建亦有顯著的改善作用[5-8],并已被證實對哮喘有良好的臨床療效[9]。本研究從肝失條達、肺失宣肅所致痰、氣、瘀互結(jié)與神經(jīng)源性炎癥的潛在關(guān)系入手,選擇NGF、TrkA作為觀察指標(biāo),以地塞米松及化痰祛瘀平喘中藥(平喘方)為對照藥物,旨在觀察化痰祛瘀疏肝法對哮喘小鼠神經(jīng)源性炎癥NGF、TrkA信號通路的早期干預(yù)作用。

        1 材料與方法

        1.1 試劑與儀器 卵清白蛋白(上海駿惠化工有限公司,批號:20110209),小鼠NGF、TrkA ELISA、試劑盒(美國RayBiotech進口分裝),NGF抗體(效價1∶50)、TrkA抗體(效價1∶100)(ABCAM);芬蘭雷勃酶標(biāo)儀(MK3),電泳儀(mini protean 3 cell,BIO-RAD公司)等。

        1.2 實驗藥物

        1.2.1 化痰祛瘀疏肝中藥/疏肝平喘方(SGPCF) 由炙麻黃、杏仁、甘草、蘇子、萊菔子、地龍干、桃仁、椒目、黃芩、柴胡、白芍、丹參組成。以1∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶2∶2∶2∶2∶1量,根據(jù)《動物實驗方法學(xué)》[10]中公式dB=dA ×RB/RA×(WA/WB)1/3(dB:B種動物的公斤體重劑量,dA:A種動物的公斤體重劑量,WA、WB:已知動物體重,RB、RA:體型系數(shù)),計算實驗劑量,用藥量相當(dāng)于臨床30 kg兒童用藥量的10倍。中藥煎煮提取方法參考李儀奎[11]等的方法,第1次加6倍水旺火煮沸后,溫火煮1 h,保溫2 h,將藥液濾出。第2次加入5倍水旺火煮沸后,溫火煮1 h,保溫2 h,將藥液濾出。煎煮2次后濾液合并濃縮,加入95%乙醇(按公式V× 60/(95-60)計算乙醇用量),冷藏靜置24 h后濾出,將濾液濃縮至流浸膏樣。具體由上海市中醫(yī)醫(yī)院中心實驗室制備。終濃度6.99g生藥/mL。

        1.2.2 化痰祛瘀平喘中藥/平喘方(PCF) 由炙麻黃、杏仁、甘草、蘇子、萊菔子、地龍干、桃仁、椒目、黃芩組成。以1∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶2∶2量,煎煮提取方法如上述,終濃度5.33 g生藥/mL。

        1.2.3 對照藥物/地塞米松(DXM) 醋酸地塞米松片(0.75 mg/片),上海信誼藥廠有限公司提供。以蒸餾水將地塞米松片劑配制成0.075 mg/mL濃度溶液。1.3 實驗動物分組及模型建立 清潔級雄性Balb/c小鼠(18±2 g,3~5周齡)50只。由上海中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物室提供(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,實驗動物許可證號:SCXK2008-0016)。室溫25℃、濕度60%~70%環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水與進食。50只小鼠根據(jù)體重用隨機數(shù)字表隨機分為5組,每組10只:空白對照組;哮喘模型組;地米組;平喘方(PCF)組;疏肝平喘方(SGPCF)組。

        除空白對照組外,其余各組小鼠均以10%OVA/AL(OH)3混合液1 mL于第1 d、第15 d行小鼠腹腔注射致敏2次。第23 d至29 d激發(fā)階段,每天將各組小鼠置于5 L密閉容器中,以5%OVA蒸餾水溶液超聲霧化吸入40 min,1次/d,共7 d。空白對照組均以等量生理鹽水行腹腔注射及霧化吸入。于首次腹腔注射前、末次激發(fā)后分別對各組小鼠呼吸頻率、體重、煩躁不安、腹肌抽搐、二便失禁、毛發(fā)豎起、活動減少、飲食減少、口鼻發(fā)紺等行為學(xué)表現(xiàn)進行觀察并記錄。用光鏡觀察各組肺組織形態(tài)學(xué)改變,包括肺內(nèi)細支氣管壁黏膜上皮、管腔內(nèi)炎性滲出物及脫落的黏膜上皮細胞、管周炎性細胞浸潤等情況,確認模型建立。

        造模成功標(biāo)準(zhǔn):呼吸頻率增快:與空白組比較,呼吸頻率增加幅度在20%以上;體重減輕:與空白組比較,體重減輕幅度在10%以上;其他癥狀:出現(xiàn)煩躁不安、腹肌抽搐、二便失禁、毛發(fā)豎起、活動減少、飲食減少、口鼻發(fā)紺等;后期取材肺泡灌洗液中總IgE升高;沉渣嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS)增多;所見肺組織病理表現(xiàn)符合哮喘表現(xiàn)。

        1.4 干預(yù)方法

        1.4.1 給藥 于第16 d至第29 d給藥。各處理組以對應(yīng)藥物0.4 mL/20 g灌胃,1次/d??瞻讓φ战M、哮喘模型組以等量生理鹽水灌胃,1次/d。

        1.4.2 取材 于第30 d取材。留取小鼠右肺肺組織:每只小鼠收集完左肺BALF后,取右肺上2葉于凍存管置-80℃冰箱凍存,制肺組織勻漿。余下右肺下2葉以10%甲醛固定,采用HE染色制肺組織病理切片,用光鏡觀察各組肺組織形態(tài)學(xué)改變;制1.0 cm× 1.0 cm×0.2 cm組織切片。

        1.4.3 檢測指標(biāo) ELISA法檢測哮喘小鼠BALF中NGF、TrkA濃度,Western blot法檢測哮喘小鼠肺組織NGF、TrkA蛋白表達。

        2 結(jié)果

        2.1 NGF在哮喘小鼠肺組織的表達

        2.1.1 NGF在哮喘小鼠BALF中的濃度(ELISA法)

        與空白組比較:模型組NGF濃度明顯升高(P<0.01);與模型組比較:地米組、PCF組及SGPCF組NGF濃度均明顯降低(P均<0.01);與地米組比較:2中藥組NGF濃度均顯著高于地米組(P均<0.01);2中藥組間比較:2中藥組NGF濃度無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表1 各組小鼠BALF中NGF濃度(ng/l)

        2.1.2 NGF蛋白在哮喘小鼠肺組織中的表達(Western blot法) 與空白組比較:模型組NGF蛋白表達顯著升高(P<0.05);與模型組比較:PCF組及SGPCF組NGF蛋白表達均顯著降低(P均<0.05),地米組NGF蛋白表達與模型組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與地米組比較:PCF組NGF蛋白表達與地米組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),SGPCF組顯著低于地米組(P<0.05);2中藥組間比較:2中藥組間NGF蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表2 各組小鼠肺組織中NGF蛋白表達(±s)

        表2 各組小鼠肺組織中NGF蛋白表達(±s)

        注:方差不齊,用Games-Howell程序兩兩比較:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

        圖1 各組小鼠肺組織中NGF蛋白表達

        2.2 TrkA在哮喘小鼠肺組織的表達

        2.2.1 TrkA在哮喘小鼠BALF中的濃度(ELISA法)與空白組比較:模型組TrkA濃度明顯升高(P<0.01);與模型組比較:地米組、PCF組及SGPCF組TrkA濃度均明顯降低(P均<0.01);與地米組比較:2中藥組TrkA濃度均顯著高于地米組(P均<0.01);2中藥組間比較:2中藥組間TrkA濃度無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表3 各組小鼠BALF中TrkA濃度(ng/L)

        圖2 各組小鼠肺組織中TrkA蛋白表達

        2.2.2 TrkA蛋白在哮喘小鼠肺組織中的表達(Western blot法) 與空白組比較:模型組TrkA蛋白表達顯著升高(P<0.01);與模型組比較:地米組、PCF組及SGPCF組TrkA蛋白表達均顯著低于模型組(P均<0.01);與地米組比較:PCF組TrkA蛋白表達與地米組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),SGPCF組顯著低于地米組(P<0.05);2中藥組間比較:2中藥組TrkA蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表4 各組小鼠肺組織中TrkA蛋白表達(±s)

        表4 各組小鼠肺組織中TrkA蛋白表達(±s)

        注:方差齊,用LSD程序兩兩比較:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01。

        3 結(jié)論

        上述結(jié)果表明,在預(yù)防性干預(yù)方式下,化痰祛瘀疏肝法對哮喘小鼠升高的NGF、TrkA濃度及上調(diào)的NGF、TrkA蛋白表達均有降低作用,上述作用總體與化痰祛瘀平喘法相似,在蛋白表達水平上疏肝平喘方顯著優(yōu)于地塞米松。提示化痰祛瘀疏肝法預(yù)防性干預(yù)哮喘小鼠神經(jīng)源性炎癥NGF-TrkA信號通路有較為確切的作用。

        4 討論

        歷代醫(yī)家對兒童哮喘病因病機的共識,五臟之中,以肺、脾、腎三臟與其關(guān)系最為密切。通常兒童發(fā)病,受內(nèi)傷七情影響較為少見。肝主疏泄,疏通氣機,調(diào)暢情志;助脾胃運化;推動血液及津液代謝。若肝氣失于條達,周身氣機不暢、重者致血液循行澀滯而不通,此與失于宣降之肺氣、伏留氣道之痰瘀、外感六淫之邪氣相互為因,加重哮喘之頑固、反復(fù)發(fā)作。自20世紀80年代以來,隨著我國社會發(fā)展,“四-二-一”家庭結(jié)構(gòu)逐步成為社會主流,獨生子女受到過多寵愛和關(guān)注,其驕恣任性的問題逐步顯露,七情致病的重要性日益被兒科醫(yī)師所關(guān)注。從中醫(yī)理論的角度可以理解為肝失疏泄,氣機失常,重者影響血液代謝和循行。

        “痰”與氣道慢性炎癥、“瘀”與氣道重構(gòu)存在相似病理基礎(chǔ),我們認為痰瘀同病、痰瘀交阻是哮喘反復(fù)發(fā)作之主要病理基礎(chǔ);治療上,應(yīng)痰瘀并重,治痰須兼活血,血活則易化痰。臨床上哮喘與反復(fù)呼吸道感染亦?;橐蚬?,痰瘀互結(jié)因而加重[12]。化痰逐瘀平喘中藥(平喘方)以宣肺、化痰、平喘為主要功效,兼顧祛瘀。前期研究中已取得較為確切的效果,在防治哮喘的機理上,與糖皮質(zhì)激素的作用途徑相似,對于哮喘Th1/Th2免疫失衡、氣道重建、氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性等病理環(huán)節(jié)均有調(diào)節(jié)作用,且隨用藥時間延長,有累加效應(yīng),其療效與地塞米松相近,但作用環(huán)節(jié)更為廣泛。

        近年有多項研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)生長因子通過誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)參與哮喘發(fā)病。Th2類細胞因子IL-13可上調(diào)哮喘大鼠淋巴細胞神經(jīng)生長因子mRNA的表達,Th1類細胞因子IL-18可下調(diào)淋巴細胞NGFm-RNA表達,兩者均呈時間和濃度依賴性,Th1/Th2類細胞因子免疫失衡可能通過調(diào)控NGFmRNA表達間接促進其誘導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥;而同時有證據(jù)顯示,NGF通過誘導(dǎo)Th1型向Th2型免疫應(yīng)答偏移來參與特應(yīng)性皮炎Th1/Th2類細胞因子免疫失衡效應(yīng)[13];而這一過程可能通過對GATA-3表達的上調(diào)進行[14]。

        本研究根據(jù)前期結(jié)論,在平喘方的基礎(chǔ)上,增強疏肝理氣活血組成,選擇柴胡、白芍、丹參等功效顯著且性味溫和的兒科常用疏肝、活血藥加入原方組成疏肝平喘方,以期對痰、氣、瘀互結(jié)的病理環(huán)節(jié)有新的干預(yù)作用。前期實驗已證明本法對哮喘小鼠氣道Th1/Th2免疫失衡相關(guān)因子有較好的調(diào)節(jié)作用[15]。研究選取NGF、TrkA作為觀察指標(biāo),目的是發(fā)現(xiàn)化痰祛瘀疏肝法對哮喘小鼠Th1/Th2免疫失衡相關(guān)的神經(jīng)源性炎癥的干預(yù)作用,為進一步深入研究中醫(yī)藥對哮喘神經(jīng)源性炎癥的干預(yù)機制提供前期基礎(chǔ)。在進一步研究中,我們考慮將Th1/Th2類細胞因子IL-13、IL-18以及NGF、TrkA共同作為觀察指標(biāo),研究化痰祛瘀疏肝法對哮喘小鼠Th1/Th2免疫失衡和神經(jīng)源性炎癥干預(yù)作用的相關(guān)性,以期發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥臨床治療哮喘的新機理。

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        (2013-03-12收稿)

        Effect of Preictal Phase Intervention of Phlegm-Stasis Resolving and Liver Soothing Method on NGF-TrkA Signaling Pathway of Murine Model of Asthma

        Zhang Xinguang1,2,Liu Fang3,Xue Zheng1,2,Li Liqing1,2,Liu Fei4,Bai Li1,2,Yu Jianer1,2
        (1 Pediatric Department of Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China;2 Pediatric Institute of Shanghai Traditional Chinese Medicine Academy,Shanghai 200071,China;3 Pediatric Department,East Hospital Affiliated to Tongji University,Shanghai 200120,China;4Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)

        Objective:To observe the effects of preictal intervention of phlegm and stasis resolving and liver soothing method on NGFTrkA signaling pathway of neurogenic inflammation of murine model of asthma.Methods:The asthmatic BALB/c mice model were established through being sensitized by intra-peritoneal injection of 10%OVA/AL(OH)3 solution,and activated by 5%ovalbumin solution.Intervention started before activation,and lung homogenate was obtained after activation.NGF and TrkA concentration in BALF were examined by ELISA,and the protein expression of NGF and TrkA concentration in lung tissue homogenate were detected by western blot.Results:In asthmatic model BALB/c mice,NGF and TrkA concentration significantly increased(P<0.01),the protein expression significantly increased(P<0.05,P<0.01).The NGF、TrkA concentration of all intervention groups decreased(P<0.01),while DXM showed a better effect than the other two intervention groups(P<0.01).The NGF protein expression in PCF and SGPCF group decreased significantly compared with model group(P<0.01),while that of DXM group was similar to model group(P>0.05).TrkA protein expression of PCF and SGPCF group were lowered(P<0.05,P<0.01),PCF group had a similar effect on NGF and TrkA with DXM,while SGPCF showed a significantly better effect than DXM(P<0.05),but the differences between PCF and SGPCF group had no statistical significance(P>0.05).Conclusion:Preictal intervention of phlegm and stasis resolving and liver soothing method can decrease the increased concentration and protein expression of NGF and TrkA.The effect is generally similar to phlegm and stasis resolving and qi regulating method,and better than dexamethasone,which indicates that preictal intervention of phlegm and stasis resolving and liver soothing method has a definite effect on the NGF-TrkA pathway of neurogenic inflammation of murine model of asthma.

        Asthma/Chinese medical therapy;Phlegm-stasis resolving and liver soothing method;Intervention

        10.3969/j.issn.1673-7202.2013.06.022

        國家自然基金項目:平喘方干預(yù)哮喘模型動物陰陽失衡的機理及拆方研究(編號:81173302);國家自然基金項目:基于NGF-TrkA通路探討肝肺同治法對哮喘模型小鼠神經(jīng)源性炎癥的影響(編號:81202723);海派中醫(yī)流派傳承研究基地(徐氏兒科)(編號:ZYSNXD-CC-HPGCJD-005)

        虞堅爾(1952—),男,醫(yī)學(xué)碩士,教授,主任醫(yī)師,博士研究生導(dǎo)師,浙江鎮(zhèn)海人,主要從事中醫(yī)兒科醫(yī)療、教學(xué)、科研工作,Tel:021-56639828,E-mail:jianeryu@hotmail.com

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