王顯紅 張博 尹時(shí)華

不同日齡乳鼠耳蝸外毛細(xì)胞底部Prestin蛋白的分布

王顯紅1張博1尹時(shí)華2

目的探討不同日齡乳鼠耳蝸外毛細(xì)胞（OHC）底部Prestin蛋白的分布。方法 分別取3、7、10日齡的Wistar乳鼠單離的耳蝸OHC，利用Prestin特異性抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察Prestin蛋白在單離OHC底部細(xì)胞膜上的表達(dá)與分布。結(jié)果 3天組乳鼠單離OHC底部細(xì)胞膜無Prestin蛋白的陽性染色；7天和10天組乳鼠的OHC底部細(xì)胞膜的中央部分可見Prestin蛋白的陽性染色。3、7、10天組中OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值分別為0.001±0.000、0.868±0.033、1.007±0.012，各時(shí)間點(diǎn)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論不同日齡乳鼠OHC基底膜Prestin蛋白的分布存在差異，隨月齡增加，Prestin蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

耳蝸； 外毛細(xì)胞； Prestin蛋白

Prestin作為外毛細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)蛋白，是電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。近年來關(guān)于Prestin蛋白在外毛細(xì)胞的表達(dá)、定位及其與外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)之間的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)。有研究［1～3］采用全基底膜免疫熒光染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Prestin主要分布在外毛細(xì)胞的側(cè)膜上，但有關(guān)外毛細(xì)胞基底部細(xì)胞膜是否有Prestin蛋白的表達(dá)尚存不同觀點(diǎn)。本研究以乳鼠為研究對象，旨在觀察不同日齡乳鼠單離外毛細(xì)胞基底部細(xì)胞膜Prestin蛋白的表達(dá)與分布。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及外毛細(xì)胞的分離 選擇出生3、7、10天的Wistar乳鼠，每組10只，雌雄不限，迅速斷頭并取出顳骨，打開聽泡置于PBS溶液中，在解剖顯微鏡下剝?nèi)ノ仛?，用游絲鑷剔除螺旋韌帶和螺旋神經(jīng)節(jié)組織后分離出含Corti器的基底膜，移除Reissner氏膜和Tectorial膜，置于濃度為0.25 mg／ml的木瓜蛋白酶中，37℃孵育10～12分鐘，輕柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液終止消化。懸液經(jīng)離心后去上清液，加入1 ml培養(yǎng)液在37℃、5%CO2孵箱孵育24 h。每組約能分離出毛細(xì)胞30～40個(gè)。

1.2 外毛細(xì)胞Prestin蛋白染色 經(jīng)24 h培養(yǎng)后的外毛細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗5 min，3次。封閉液（10%山羊血清和1%BSA）封閉30 min，PBS浸洗5 min，3次。1：1 000羊抗Prestin多克隆抗體（Prestin Antibody（C-16）：Sc-22694，Santa Cruz）4℃過夜，室溫復(fù)溫10 min，PBS浸洗5 min，3次。1：64的FITC標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗抗體（BA1110，武漢博士得）在室溫下孵育一小時(shí)，PBS浸洗5 min，3次。封片后熒光顯微鏡下觀察。陽性染色為綠色熒光，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用Image-Proplus圖像分析軟件測定外毛細(xì)胞基底膜Prestin蛋白的光密度值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察結(jié)果 Prestin抗體標(biāo)記的外毛細(xì)胞細(xì)胞側(cè)膜上均有較強(qiáng)的綠色熒光染色（圖1a～c）。3天組乳鼠OHC基底部細(xì)胞膜（圖1a紅色箭頭所指處）無Prestin蛋白陽性染色；7天和10天組乳鼠OHC基底部細(xì)胞膜的中央部分（圖b、c紅色箭頭所指處）可見Prestin蛋白的綠色熒光染色。2.2 OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值測量結(jié)果 3、7、10天組中OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值分別為0.001±0.000、0.868±0.033、1.007±0.012。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，3天組與7天和10天組OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；7天組與10天組OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

哺乳動(dòng)物耳蝸具有頻率選擇性和放大效應(yīng)，這一生理特征被認(rèn)為與耳蝸OHC電運(yùn)動(dòng)有關(guān)。當(dāng)外界聲音引發(fā)耳蝸內(nèi)液體波動(dòng)及基底膜機(jī)械振動(dòng)時(shí)，內(nèi)毛細(xì)胞和OHC表面的纖毛束可將這種機(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，其中，內(nèi)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)并將聲音信息傳入大腦，OHC將電信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞長度的機(jī)械性改變，并反饋給基底膜，進(jìn)一步增強(qiáng)基底膜的振動(dòng)，通過正反饋?zhàn)饔檬箖?nèi)毛細(xì)胞感受的機(jī)械刺激被放大［4］。Prestin是一種特異性存在于耳蝸OHC的馬達(dá)蛋白，是OHC電運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)Prestin表達(dá)［1，2，5］。將小鼠的Prestin基因敲除之后，OHC無Prestin表達(dá)，胞體縮短，OHC變性，耳蝸敏感性降低［6～8］。

圖1 各組乳鼠OHC胞膜prestin蛋白染色圖

Belyantseva等［1］采用全基底膜免疫熒光染色的方法研究Prestin蛋白在OHC的定位和表達(dá)，用免疫熒光標(biāo)記Prestin抗體，發(fā)現(xiàn)熒光集中在OHC側(cè)膜，而OHC纖毛、底部及胞質(zhì)等其他部位無熒光標(biāo)記，提示Prestin蛋白分布在OHC的側(cè)膜上。但近年來有人運(yùn)用熒光雙染及復(fù)合染色等方法觀察發(fā)現(xiàn)，成年大鼠單離OHC除了側(cè)膜有明顯的Prestin抗體陽性染色之外，在OHC底部的細(xì)胞膜上也有較強(qiáng)的陽性染色，同時(shí)在細(xì)胞核平面以下的側(cè)膜即側(cè)膜與基底部細(xì)胞膜結(jié)合處也有陽性染色［9］。

本實(shí)驗(yàn)選用不同日齡乳鼠單離外毛細(xì)胞，利用Prestin特異性抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察Prestin在耳蝸OHC細(xì)胞膜上的表達(dá)與分布，結(jié)果顯示，3天組乳鼠單離OHC基底部細(xì)胞膜上無Prestin蛋白的陽性染色；7天和10天組乳鼠的OHC基底膜的中央部分觀察到了Prestin蛋白的陽性染色，且分布不斷增加，說明不同日齡乳鼠OHC基底膜上Prestin蛋白的分布存在差異。

與全基底膜免疫熒光染色顯示方法不同的是，本實(shí)驗(yàn)采用的是單離耳蝸OHC，顯示除側(cè)膜外，在OHC基底部的細(xì)胞膜上也有陽性染色，其原因可能是，活體狀態(tài)下OHC坐于Deiters細(xì)胞上，OHC底部被神經(jīng)末梢與OHC之間的突觸所包繞，采用全基底膜免疫熒光染色時(shí)，OHC底部因被遮蔽而無法進(jìn)行Prestin抗體染色［10］，從而出現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

曾有研究者提出［9，11］，Prestin蛋白的表達(dá)可被控制，并且在細(xì)胞生命周期中不斷更新，在OHC的底部可能存在Prestin蛋白庫，合成的Prestin蛋白由底膜向側(cè)膜擴(kuò)散。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，這種推測值得商榷。

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（2013-03-06收稿）

（本文編輯 雷培香）

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.024

時(shí)間：2013-7-3 16：57

R339.16

A

1006-7299（2013）04-0407-02

1 湖北科技學(xué)院耳鼻咽喉教研室（咸寧 437100）； 2 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

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