徐 寬，沈鶴柏，朱龍章

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

納米金免疫層析法定量檢測(cè)尿RBP

徐 寬，沈鶴柏，朱龍章*

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

應(yīng)用納米金免疫層析技術(shù)（雙抗夾心法）和檸檬酸三鈉還原法建立一種對(duì)尿RBP的快速定量檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上研制出快速檢測(cè)試紙條.該試紙條用納米金免疫層析定量分析儀可在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)RBP定量檢測(cè)，檢測(cè)限為150μg／L（相當(dāng)于150 ng／mL），檢測(cè)范圍為150～5000μg／L.與尿微量白蛋白（ALB）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）、β2-微球蛋白（β2-MG）、尿纖維連接蛋白（FN）、溶菌酶（LZM）等腎臟疾病標(biāo)志物無交叉反應(yīng).該方法特異性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高、范圍廣、簡(jiǎn)便快捷，在近端腎小管的損傷、糖尿病腎病等腎臟疾病的早期診斷及過程監(jiān)控中具有較為廣泛的臨床應(yīng)用.

尿RBP；納米金；免疫層析；定量檢測(cè)

0 前 言

視黃醇結(jié)合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP）是體內(nèi)一類將VitA從肝臟中轉(zhuǎn)運(yùn)至靶組織以及實(shí)現(xiàn)VitA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的特異性運(yùn)載蛋白，在協(xié)助VitA發(fā)揮生理功能中起著不可替代的作用［1］.研究發(fā)現(xiàn)RBP廣泛存在于正常人的體液中，屬于α1-球蛋白［2］.RBP主要以視黃醇和前白蛋白結(jié)合的復(fù)合物形式存在，當(dāng)復(fù)合物中視黃醇與靶細(xì)胞結(jié)合后，復(fù)合物中的視黃醇結(jié)合蛋白便與前白蛋白分離而從腎小球?yàn)V出，并由近端腎小管上皮細(xì)胞吸收、降解［3］.近年來的深入研究表明，RBP含量的改變能夠敏感地反映近端腎小管的損傷，實(shí)現(xiàn)糖尿病、腎病的早期診斷［4］.

彭彥孟等［5］在采用ELISA法對(duì)241例腎臟疾病患者的尿RBP進(jìn)行檢測(cè)以探討尿RBP在早期腎小管損傷的診斷價(jià)值.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腎損傷患者的尿RBP較正常對(duì)照組明顯增高；同時(shí)，尿RBP在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性好且不易被破壞，是反映腎小管受損的敏感指標(biāo).王瑞石等［6］在對(duì)4種經(jīng)腎穿刺活檢診斷的腎病患者進(jìn)行尿RBP的變化與腎小管間質(zhì)形態(tài)學(xué)改變之間的關(guān)系，以及腎功能對(duì)其影響的研究中指出，尿RBP與腎小管間質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變有良好的相關(guān)性，其水平高低直接反應(yīng)腎小管間質(zhì)的病變程度.因此，尿RBP是反映近端腎小管功能的特異性標(biāo)志物，可能對(duì)鑒別診斷各種腎臟疾病小管間質(zhì)病理受損及受損程度具有重要臨床意義.

納米金免疫層析技術(shù)(GICA）［7-8］是20世紀(jì)90年代以來發(fā)展起來的一種將納米生物技術(shù)、色譜層析技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合的固相膜免疫層析方法，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展成的一種新型體外診斷技術(shù)［9］.雖然近年來該方法發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用，但采用該方法實(shí)現(xiàn)對(duì)RBP的定量檢測(cè)仍未見報(bào)道.

目前臨床上對(duì)RBP的定量檢測(cè)已經(jīng)成為腎功能檢測(cè)的一種有效且成熟的方法，而ELISA法和免疫比濁法是各大醫(yī)院目前普遍采用的方法.但這兩種方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作步驟比較繁瑣、對(duì)操作人員的專業(yè)技術(shù)要求較高、所需儀器也較為昂貴等，這給基層醫(yī)院對(duì)RBP定量檢測(cè)的普及造成了不小困難.而本研究采用納米金免疫層析技術(shù)，正好在彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的缺陷與不足的同時(shí)，還能實(shí)現(xiàn)對(duì)尿RBP的定量檢測(cè)，對(duì)近端腎小管的損傷、糖尿病腎病等腎臟類疾病的大規(guī)模篩查、早期診斷及過程監(jiān)控都具有重要影響.

1 材 料

1.1 主要儀器

H01-1B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Thermo MμLtiskan Spectrμm多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific）；掃描電子顯微鏡SEM(JEM- 2010，JEOL，Japan）；AllegraTM64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫爾特有限公司）；渦旋儀(上海醫(yī)科大學(xué)設(shè)備廠）；激光Nano Zetasizer電位及粒徑測(cè)定儀(Malvern公司）；HM3010單維往復(fù)式劃膜儀，ZQ-2000微電腦自動(dòng)斬切機(jī)(上海金標(biāo)生物科技有限公司）；DH-252BS除濕機(jī)(杭州川井電器有限公司）；BN-Q2000型納米金免疫層析定量分析儀(上海柏納生物技術(shù)有限公司）；真空干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司）；純水儀(上海力康公司）.

1.2 主要試劑

鼠抗RBP單克隆抗體(S-64-11）、(S-113-7）(上海中科英沐生物科技有限公司）；RBP標(biāo)準(zhǔn)品(北京西美杰生物有限公司）；二抗(上海捷寧生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白(Sigma公司）；氯金酸(上海精細(xì)化工研究所）；無水碳酸鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸三鈉(上海青析化工有限公司）；氯化鈉(上海文旻生化科技有限公司）；蔗糖(AMRESCO公司）；雙蒸水(自來水由純水儀制得）；硝酸纖維素膜(NC膜）(美國(guó)Millipore公司）；玻璃纖維膜8964(Ahlstorm公司）；PVC塑料底板、吸水紙(上海金標(biāo)生物科技有限公司）.

2 試紙條的制備

2.1 納米金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法［10-11］制備20 nm納米金.向經(jīng)酸洗凈并干燥過的錐形瓶中加入99 mL雙蒸水，再加入1%氯金酸溶液1 mL.將錐形瓶置于數(shù)顯恒溫磁力攪拌器上加熱至沸騰，沸騰后在劇烈的攪拌下一次性迅速準(zhǔn)確地加入新鮮配制的1%檸檬酸三鈉溶液2 mL，當(dāng)溶液完全變?yōu)橥该鞯木萍t色時(shí)，繼續(xù)煮沸15 min，即制得所需的納米金，常溫下繼續(xù)攪拌冷卻至室溫，4℃儲(chǔ)存待用.

2.2 納米金標(biāo)記抗體條件選擇及標(biāo)記

2.2.1 最適pH值的確定

分別取1 mL納米金溶液用0.1 mol／L碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0、7.0、8.0、9.0、10.0.各取不同pH的納米金溶液200μL至5支EP管中，再加入4μg鼠抗RBP單克隆抗體(S-113-7），混合均勻，室溫反應(yīng)10 min后，向其中加入40μL 10%氯化鈉溶液，靜置2 h，觀察各管顏色變化.

2.2.2 最適蛋白量的確定

向8支EP管中分別加入200μL納米金溶液，用0.1 mol／L碳酸鉀溶液調(diào)至最適pH值.再分別加入0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μg鼠抗RBP單克隆抗體(S-113-7），反應(yīng)20 min后，各管加入10%氯化鈉溶液40μL，靜置2 h，觀察各管顏色變化.

2.2.3 納米金的標(biāo)記

取納米金溶液1mL，用0.1mol／L碳酸鉀溶液調(diào)至最適pH值，加入適量的鼠抗RBP單克隆抗體(S -113-7），混合均勻，反應(yīng)20 min后，加入10%BSA溶液20μL，混合均勻，反應(yīng)20 min.在13000 r／min、4℃條件下離心15 min，棄去上清液.沉淀物用硼酸鹽緩沖溶液(含5%BSA）重懸至原體積.再次以同樣的條件離心后棄去上清液，濃縮至原體積的1／ 20，即得納米金-RBP復(fù)合物，4℃保存.

2.3 硝酸纖維素膜的制備

將NC膜貼在具有粘性的PVC底板中間，用單維往復(fù)劃膜儀在NC膜的不同位置噴點(diǎn)鼠抗RBP單克隆抗體(S-64-11）及羊抗鼠二抗，自上至下依次為質(zhì)控線(C線）、檢測(cè)線(T線），37℃烘干2 h備用.

2.4 結(jié)合墊的制備

選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將上述制備的納米金-RBP復(fù)合物用硼酸緩沖溶液(含0.1 gPVP，0.1 gPEG，2.5 g蔗糖等）稀釋至原體積的4／ 5，并噴于結(jié)合墊上，37℃烘干2 h備用.

2.5 樣品墊的制備

選用玻璃纖維素膜作為樣品墊材料，將其放入樣品墊處理液(含BSA，吐溫等的0.01 mol／L pH＝7.4 PBS）中浸泡后，37℃真空干燥2 h備用.

圖1 試紙條的組裝效果圖

2.6 試紙條的組裝

將結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙依次按由下到上的順序粘貼在PVC底板上.用ZQ微電腦自動(dòng)斬切機(jī)切割成4 mm寬的試紙條.將切好的試紙條裝在檢測(cè)卡(如圖1）里面與干燥劑封裝在鋁箔袋內(nèi)37℃保存待用.

2.7 試紙條的結(jié)果判定（如圖2）

當(dāng)樣品滴加至加樣孔反應(yīng)15 min后，若C線、T線均為紅色且T線呈深紅，則判定為強(qiáng)陽性；若C線、T線均為紅色且T線呈淺紅，則判定為弱陽性；若只有C先呈紅色，則判定為陰性；若C線無色，則判定為試紙條無效.

圖2 納米金免疫層析法檢測(cè)判定圖

3 結(jié)果與分析

3.1 納米金的表征

3.1.1 納米金的紫外-可見吸收光譜

用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在400～600 nm波段內(nèi)對(duì)制備的納米金進(jìn)行掃描.從圖3中可以看出，20 nm的納米金在520 nm處有一最大吸收值，這與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致［12］，表明此粒徑的納米金適合標(biāo)記抗體.

圖3 納米金紫外—可見吸收曲線

3.1.2 納米金的粒徑及Zeta電位分析

新制備的納米金平均Zeta電位是-41.9mV(圖4），表明此電位的納米金可較好地同RBP結(jié)合.納米金顆粒的平均直徑大約為20.57 nm，其中分布完全是24.06 nm，分布寬度為9.260 nm，多分散性PDI＝0.148(圖5），表明制備的納米金符合免疫試驗(yàn)的要求.

圖4 納米金的Zeta電位掃描曲線

圖5 納米金的粒徑分布曲線

圖6 納米金的電鏡TEM圖

3.1.3 納米金顆粒的透射電鏡觀察

新制備的納米金用透射顯微鏡(TEM）進(jìn)行掃描(圖6），從圖6中可以看出納米金顆粒粒徑在20 nm左右，形貌接近于球形，而且粒徑分布比較均一.此納米金顆粒粒徑分析結(jié)果與Zetasizer電位分析儀測(cè)定結(jié)果相一致，可以滿足納米金標(biāo)記抗體實(shí)驗(yàn)的要求.

3.2 納米金標(biāo)記條件的確定

3.2.1 最適pH值的確定

RBP單抗在pH為6～10中顏色發(fā)生著不同的變化，其中隨著pH逐漸增大，顏色的變化程度逐漸減弱.當(dāng)pH＜8.0時(shí)，管中溶液顏色呈不同程度的灰藍(lán)色；當(dāng)pH≥8.0時(shí)，管中溶液顏色基本無變化.因此，可以確定納米金標(biāo)記的最佳pH值為9.0.

3.2.2 最適RBP抗體量的確定

當(dāng)200μL納米金溶液中RBP抗體量小于4μg時(shí)，溶液不同程度地發(fā)生聚沉，顏色變成灰色、紫色；而RBP抗體量大于3μg時(shí)，溶液顏色為酒紅色不變，所以200μL體系中最適抗體量為4μg，即20 mg／L(相當(dāng)于20μg／mL），實(shí)際工作中增加20%，故實(shí)際用量為24 mg／L(圖7）.圖7中RBP抗體量分別為：0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g／200 L.

圖7 不同抗體量的RBP和納米金結(jié)合顯色圖

3.3 試紙條的靈敏度分析

檢測(cè)一系列不同濃度的RBP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶液濃度依次為：0、10、30、60、100、150、200、300、500、1000μg／L.在15 min內(nèi)觀察各試紙條的顯色情況，當(dāng)濃度為1000μg／L時(shí)，T線為深紅色，C線稍淺.隨著濃度逐漸降低，T線顏色逐漸變淺，C線逐漸變深.當(dāng)濃度為150μg／L時(shí)，T線顏色幾乎消失，C線顏色最深，由此判斷，試紙條的靈敏度可達(dá)150μg／L.

3.4 試紙條的重復(fù)性試驗(yàn)

取 300， 1500，5000μg／L 3種濃度的RBP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照相同的檢測(cè)方法對(duì)每個(gè)濃度平行檢測(cè)6次，并用納米金免疫層析定量分析儀掃描讀取T／C值.每個(gè)濃度6次檢測(cè)的T／C值的標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值即為變異系數(shù)(即為CV值），計(jì)算得到3種濃度RBP標(biāo)準(zhǔn)品溶液的CV值分別為9.83%、9.45%、8.89%，該CV值相近，說明所得的試紙條具有良好的重復(fù)性.

3.5 試紙條的特異性實(shí)驗(yàn)

將尿微量白蛋白(ALB）、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF）、β2-微球蛋白(β2-MG）、尿纖維連接蛋白(FN）、溶菌酶(LZM）用PBS稀釋到60、100、200、300、500μg／L等不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有C線變紅，T線沒有變化(表1），說明該試紙條的特異性良好.

表1 試紙條特異性實(shí)驗(yàn)

3.6 試紙條的檢測(cè)范圍的確定

用0.01 mol／L pH＝7.4 PBS緩沖液將RBP標(biāo)準(zhǔn)品配制成終濃度分別為150、300、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000μg／L的RBP溶液，用試紙條檢測(cè)T／C值，每個(gè)濃度測(cè)定3次，取其平均值.測(cè)定結(jié)果表明，從6000μg／L開始，T／C值出現(xiàn)下滑(圖8）.因此，確定RBP試紙條的檢測(cè)下限為150μg／L，上限為5000μg／L.

圖8 RBP標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為150～5000μg／L時(shí)的試紙條檢測(cè)結(jié)果圖

3.7 RBP定量測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

在最優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，以濃度為橫坐標(biāo)，T／C值為縱坐標(biāo)作圖，建立納米金定量檢測(cè)RBP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.樣品濃度為150～5000μg／L時(shí)，每個(gè)濃度檢測(cè)3次，對(duì)納米金免疫層析定量分析儀掃描得到的T／C值取平均值(表2）.RBP濃度與T／C值之間呈良好的對(duì)數(shù)關(guān)系(圖9），對(duì)數(shù)回歸方程為Y＝0.7072 ln(x）-3. 4867，相關(guān)系數(shù)R2＝0. 9981，對(duì)數(shù)關(guān)系良好.

表2 RBP定量檢測(cè)結(jié)果(37℃）

3.8 試紙條的穩(wěn)定性

通過實(shí)驗(yàn)可以得出，RBP納米金免疫層析定量檢測(cè)試紙條在4℃和室溫下保存4個(gè)月，37℃下保存20 d，試紙條對(duì)RBP的檢測(cè)結(jié)果沒有發(fā)生顯著變化.RBP濃度與免疫金標(biāo)層析儀讀數(shù)T／C值之間仍然呈良好的對(duì)數(shù)關(guān)系(表3、圖10），對(duì)數(shù)回歸方程為Y＝0.685 ln(x）-3. 4337，相關(guān)系數(shù)R2＝0. 9966，對(duì)數(shù)關(guān)系良好.

表3 37℃保存20 d后RBP定量檢測(cè)結(jié)果

圖10 20d后納米金免疫層析試紙條檢測(cè)RBP標(biāo)準(zhǔn)品系統(tǒng)擬合工作曲線

該研究結(jié)果表明，所得的試紙條在4℃、室溫和37℃下穩(wěn)定性好.依據(jù)阿倫尼烏斯公式：K＝A e(-Ea／RT），其中K為速率常數(shù)、R為摩爾氣體常量、T為熱力學(xué)溫度、Ea為表觀活化能(約等于19.5 Kcal／mol）、A為指前因子.可以推算，37℃條件下放置20 d相當(dāng)于正常條件下有效期為2年.

4 結(jié) 論

(1）利用納米金免疫層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)RBP的快速定量檢測(cè).采用雙抗夾心法，以1對(duì)RBP單抗分別用作免疫金抗體檢測(cè)線處抗體，以羊抗鼠作質(zhì)控線.通過利用儀器讀取納米金的顏色強(qiáng)弱的信號(hào)以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè).此法克服了傳統(tǒng)方法的諸多不足，為臨床對(duì)RBP的腎小管損傷大規(guī)模篩查、診斷以及術(shù)后監(jiān)測(cè)提供了一種全新的有效定量檢測(cè)方法.

(2）利用Frens法制備的20 nm的納米金形貌均一、分散性好，符合免疫層析反應(yīng)的各項(xiàng)要求.通過對(duì)樣品墊處理液、硼酸緩沖溶液、抗體濃度等不斷優(yōu)化，較好地規(guī)避了可能出現(xiàn)的假陽性、假陰性，并在此基礎(chǔ)之上建立了具有較寬的檢測(cè)范圍和較低的檢測(cè)限的快速定量檢測(cè)體系.

(3）建立的快速定量檢測(cè)RBP體系與尿微量白蛋白(ALB）、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF）、β2-微球蛋白(β2-MG）、尿纖維連接蛋白(FN）、溶菌酶(LZM）沒有交叉反應(yīng)，重復(fù)性以及穩(wěn)定性良好.在4℃和室溫下可以保存4個(gè)月，具有廣泛的醫(yī)學(xué)、研究實(shí)用價(jià)值.

(4）通過研制的試紙條對(duì)RBP標(biāo)準(zhǔn)品的定量檢測(cè)結(jié)果分析，表明該試紙條的最低檢測(cè)限可達(dá)150μg／L.同時(shí)在150～5000μg／L范圍內(nèi)具有良好的對(duì)數(shù)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.99.此法在快速(15 min顯示結(jié)果）檢測(cè)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了有效的定量，將深刻改變目前臨床對(duì)RBP的檢測(cè)方式.

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Gold nanoparticle immunochromatographic assay for quantitative detection of urinary RBP

XU Kuan，SHEN Hebai，ZHU Longzhang*
(College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

A rapid quantitative detection of urinary RBP was established by using nano-gold immunochromatography(sandwich method）and trisodium citrate reductionmethod and a rapid immunochromatographic test strip was developed.Theimmunochromatographic test strip can quantitatively detect RBPwithin 15minutes.The detection limitwas150ng／mL and detection rangewas from 150 to 5000 ng／mL.There were no cross-reactions with others kidney diseasemarkers，such as urinary albumin(ALB），transferrin protein(TRF），β2-microglobulin(β2-MG），urinary fiber connecting protein(FN），and lysozyme(LZM）.The results indicate that it is a quick and simplemethod with strong specificity，high sensitivity，and wide detection range.The rapid detection method will have extensive clinical applications in the early diagnosis of proximal tubular damage，kidney disease，diabetic nephropathy，and processmonitoring.

Urinary RBP；nano-gold；immunochromatographic assay；quantitative detection

O 648

A

1000-5137(2013）02-0154-07

（責(zé)任編輯：郁 慧）

2012-12-21

上海市教委基金(11nm0505300）

徐 寬(1986-），男，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生；朱龍章(1956-），男，上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教授.

*通信作者