朱虹，陳珵，凌峰，邵晨，余敏，邵世和

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

CagL(cytotoxin-associated gene L)蛋白是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣsecretion system，TFSS)菌毛結(jié)構(gòu)的表面蛋白，橋聯(lián)TFSS與靶細(xì)胞的特異性黏附。CagL蛋白分子上的RGD基序被宿主細(xì)胞上的整合素α5β1受體所識別，可激活整合素依賴性的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，介導(dǎo)CagA蛋白在胞內(nèi)定位，啟動及穩(wěn)固CagA的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致IL-8水平升高［1］。本實(shí)驗(yàn)以CagL蛋白為研究對象，原核表達(dá)并制備CagL融合蛋白，以其為抗原免疫BALB/c小鼠;運(yùn)用細(xì)胞融合技術(shù)將免疫的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合后獲得雜交瘤細(xì)胞，通過有限稀釋法篩選得到3株能夠穩(wěn)定分泌抗CagL蛋白單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)的雜交瘤細(xì)胞株，并對其性質(zhì)進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸埃希菌E.coli BL21(DE3)，江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存;原核表達(dá)載體pET-28a(+)-cagL，本課題組自行制備;H.pylori NCTC11637標(biāo)準(zhǔn)菌株、H.pylori 26695標(biāo)準(zhǔn)菌株，均為中國疾病預(yù)防控制中心張建中教授饋贈;H.pylori臨床分離株M13，第三軍醫(yī)大學(xué)郭軍教授饋贈;H.pylori臨床分離株來自山東省威海市市立醫(yī)院送檢的兩份胃黏膜標(biāo)本，編號HP-1和HP-2。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性BALB/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，免疫接種小鼠為5～7周齡，腹腔積液制備時(shí)小鼠8周齡以上。

1.3 主要試劑

IPTG購自TaKaRa公司;Ni2+-NTA親和層析柱購自Qiagen公司;預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、HT選擇培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司;PEG細(xì)胞融合劑購自Sigma公司;HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(H+L)抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司公司;哥倫比亞培養(yǎng)基、微需氧袋購自O(shè)xoid公司;PVDF蛋白免疫印跡反應(yīng)膜購自Bio-Rad公司;鼠單克隆抗體快速分型試劑盒購自Thermo公司。其他化學(xué)試劑均為分析純，按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配制。

1.4 免疫原的制備

幽門螺桿菌CagL蛋白基因工程重組菌(本課題組自行制備)經(jīng)37℃振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加IPTG(終濃度1.0 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)4～6 h;收集菌液，超聲破菌，離心后收集上清;Ni2+-NTA親和柱純化融合蛋白，12%SDS-PAGE電泳并分析目的蛋白的表達(dá)情況及其純度。

1.5 CagL蛋白單克隆抗體的制備

1.5.1 小鼠的免疫 400 μg/mL CagL融合蛋白與等體積完全弗氏佐劑混合乳化，注射于6周齡雌性BALB/c小鼠頸背部皮下，每只0.4 mL;兩周后用等體積不完全弗氏佐劑免疫，劑量及途徑不變;1周后抗原量降為200 μg/mL進(jìn)行免疫接種;1周后小鼠腹腔注射100 μg/mL CagL蛋白，每只0.1 mL;3 d后間接ELISA法檢測多抗效價(jià)，效價(jià)達(dá)到預(yù)期狀態(tài)時(shí)再進(jìn)行末次尾靜脈加強(qiáng)免疫1次，3 d后進(jìn)行融合。

1.5.2 小鼠骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 按照文獻(xiàn)［2］方法活體制備小鼠骨髓瘤 SP2/0細(xì)胞。將1×106SP2/0細(xì)胞接種在6～8周齡正常雌性BALB/c小鼠背部皮下兩側(cè)，大約10～15 d后注射部位長出實(shí)體瘤，無菌取出實(shí)體瘤用于融合實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 將末次加強(qiáng)免疫的小鼠脾細(xì)胞與實(shí)體瘤SP2/0細(xì)胞在PEG的作用下進(jìn)行融合，融合10 d后篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，再用有限稀釋法經(jīng)3次亞克隆篩選出能穩(wěn)定分泌目的蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并擴(kuò)大培養(yǎng)和及時(shí)凍存。

1.6 腹腔積液的制備與純化

將8周齡雌性BALB/c小鼠腹腔接種滅菌液體石蠟，每只0.3 ～0.5 mL，10 d 后每只小鼠腹腔接種1×106雜交瘤細(xì)胞，待腹部膨大后無菌收集腹腔積液，離心獲得上清液，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 CagL蛋白單克隆抗體的鑒定

1.7.1 免疫球蛋白類型鑒定 將待測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)適當(dāng)比例稀釋后，按鼠單克隆抗體快速分型試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取D(450 nm)值，D(450 nm)≥0.2為陽性，陽性者即為該mAb的免疫球蛋白類型。

1.7.2 效價(jià)測定 采用間接ELISA法測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹腔積液中mAb的效價(jià)。1.0 μg/mL CagL蛋白過夜包被;1%BSA封閉;待測培養(yǎng)上清或腹腔積液依次做梯度倍比稀釋，每孔100 μL，設(shè)置陰性、陽性及空白對照，37℃孵育2 h;洗板后加入工作濃度的酶標(biāo)二抗，37℃孵育1 h;洗板后加TMB底物顯色液，避光37℃孵育10 min，最后加終止液，酶標(biāo)儀讀取D(450 nm)值。以陽性光密度值與陰性光密度值的比值≥2.1時(shí)最大稀釋倍數(shù)為細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹腔積液中mAb的效價(jià)。

1.7.3 非競爭ELISA法測定mAb的相對親和力用相對親和常數(shù)(Kaff)的大小來表示相對親和力［3］。CagL 蛋白稀釋成 0.25、0.50、1.00、2.00 μg/mL 4個濃度(四者濃度之比為1∶2∶4∶8)過夜包被;1%BSA封閉;將待檢單抗進(jìn)行倍比稀釋，每孔100 μL，37℃孵育2 h;其余步驟同前面的間接ELISA法。酶標(biāo)儀讀取D(450 nm)值。以D(450 nm)值為縱坐標(biāo)，抗體濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制4種濃度的抗原包被條件下單抗的結(jié)合反應(yīng)曲線。根據(jù)結(jié)合反應(yīng)曲線中50%D(450 nm)所對應(yīng)的抗體濃度［Ab］計(jì)算 Kaff值，計(jì)算公式:Kaff=(n－2)/2 ×(n［Ab'］－［Ab］)，單位為 L/mol，［Ab'］(mol/L)是抗原濃度為［Ag'］時(shí)50%D(450 nm)值所對應(yīng)的抗體濃度，［Ab］(mol/L)是抗原濃度為［Ag］時(shí)50%D(450 nm)值所對應(yīng)的抗體濃度。

1.7.4 相加ELISA法初步鑒別單抗識別表位的異同［4］每孔包被的CagL蛋白終量為50 ng;包被過夜后1%BSA封閉;稀釋待測mAb到各自飽和時(shí)的濃度，每一種單抗各自單獨(dú)加入100 μL/孔，再以兩兩各50 μL混合加入每孔，注意保持混合后各抗體的飽和濃度;其余步驟同前面的間接ELISA法。酶標(biāo)儀測得不同的單抗在各自飽和濃度下反應(yīng)的D(450 nm)值及兩兩混合反應(yīng)的D(450 nm)值。再計(jì)算加成指數(shù)(AI)，公式:AI=［2×D1+2/(D1+D2)－1］×100% ，其中D1、D2為不同株的兩種抗體各自的D(450 nm)值，D1+2為兩者混合的D(450 nm)值。選用50% 為判別標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)AI＞50%時(shí)，兩種抗體識別兩個不同的表位;當(dāng) AI＜50%時(shí)，兩者識別相似或相同的表位。

1.7.5 蛋白質(zhì)印跡法鑒定mAb的特異性 按常規(guī)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，加樣樣本為CagL純化蛋白、誘導(dǎo)表達(dá)后E.coli BL21全菌蛋白、兩株H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株的全菌蛋白、3株H.pylori臨床株的全菌蛋白，用不含表達(dá)載體的E.coli BL21全菌蛋白作為對照。

1.8 凍溶法檢測雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性

將分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株在液氮中凍存3個月后復(fù)蘇、傳代，用間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞分泌mAb的效價(jià)，并判斷其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 CagL免疫原的表達(dá)及鑒定

純化的CagL蛋白樣品SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約為32 000處可見特異性目的條帶;Quantity One軟件灰度掃描分析表明融合蛋白的純度達(dá)85%以上，見圖1。

圖1 SDS-PAGE電泳分析CagL融合蛋白的表達(dá)Fig 1 SDS-PAGE analysis of the expression of CagL fusion protein

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

經(jīng)過細(xì)胞融合、間接ELISA法的初篩、復(fù)檢以及3次亞克隆，最終獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗CagL蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株，將其命名為HPL-1C9、HPL-2G10和 HPL-3E6。

2.3 單抗免疫球蛋白的類型

3株mAb的免疫球蛋白類別及亞型見表1。

2.4 單克隆抗體的效價(jià)

間接ELISA法檢測表明3株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的mAb效價(jià)均在1∶64～1∶128之間;純化后腹腔積液型mAb的效價(jià)均在1∶16 000以上，見表1。

2.5 相對親和力

經(jīng)曲線回歸擬合抗體濃度與D(450 nm)的曲線模型，得出50%D(450 nm)對應(yīng)的抗體濃度，計(jì)算出3株mAb的相對親和常數(shù)，見表1。結(jié)果表明3株mAb的親和常數(shù)均在109數(shù)量級，具有較好的抗原結(jié)合能力。

表1 3株單克隆抗體的部分特性Tab 1 Some characterization of three mAbs against CagL

2.6 抗原表位的分析

經(jīng)相加ELISA法計(jì)算得出3株mAb的加成指數(shù)，見表 2。HPL-1C9與 HPL-2G10的 AI為72%，HPL-1C9與 HPL-3E6的 AI為 64%，HPL-2G10與HPL-3E6的 AI為52%，均大于50%，表明3株mAb的抗原識別表位各不相似。因此，本實(shí)驗(yàn)獲得的3株單抗分別屬于3種不同的抗原決定簇。

2.7 特異性的鑒定

純化蛋白、誘導(dǎo)表達(dá)后的E.coli BL21(DE3)全菌蛋白、標(biāo)準(zhǔn)菌株H.pylori NCTC 11637及26695的全菌蛋白、H.pylori臨床株 M13、Hp-1、Hp-2全菌蛋白的蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，3株mAb均能與純化蛋白、誘導(dǎo)后E.coli BL21(DE3)全菌蛋白有特異性結(jié)合，在32 000處出現(xiàn)特異性條帶(圖2);HPL-1C9和HPL-3E6單抗能夠與標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株的全菌蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，在26 000處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)，與E.coli BL21(DE3)全菌蛋白對照無特異性結(jié)合，但HPL-2G10與標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株的全菌蛋白未見特異性結(jié)合。

表2 相加ELISA反應(yīng)結(jié)果Tab 2 Absorbance of ELISA additivity test

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測3株mAb與CagL純化蛋白及誘導(dǎo)后的E.coli BL21(DE3)全菌蛋白Fig 2 Western blotting analysis of three mAbs with the CagL fusion protein and the whole protein extracted from induced E.coli BL21

圖3 HPL-1C9和HPL-3E6分別與不同H.pylori菌株全菌蛋白的蛋白質(zhì)印跡Fig 3 Western blotting analysis of mAb of both HPL-1C9(A)and HPL-3E6(B)with the whole protein extracted from different H.pylori strains

2.8 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性

雜交瘤細(xì)胞株凍存3個月復(fù)蘇后體外連續(xù)傳代，間接ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)均維持在1∶16左右，表明仍可穩(wěn)定分泌單克隆抗體。

3 討論

幽門螺桿菌是一種定植于人胃部的致病菌，全球人口的攜帶率為50%，其中約10% ～15% 的個體在感染后出現(xiàn)臨床癥狀，且胃黏膜發(fā)生不同程度的病理變化，如炎癥、潰瘍甚至癌變［5］。H.pylori已被證實(shí)是慢性萎縮性胃炎、消化道潰瘍的主要病因，且與誘生胃腺癌、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等的發(fā)生密切關(guān)聯(lián)，WHO將其列為Ⅰ類致癌因子［6］。

CagL蛋白是幽門螺桿菌TFSS菌毛結(jié)構(gòu)的表面蛋白，橋聯(lián)TFSS與靶細(xì)胞的特異性黏附，不但能激活整合素依賴的細(xì)胞信號通路，還具有與纖維黏連蛋白相似的功能，能直接誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞形成黏著斑、刺激AGS細(xì)胞的擴(kuò)散。這說明CagL蛋白能夠模擬纖維黏連蛋白觸發(fā)表皮生長因子受體(EGFR)、人表皮生長因子受體3(Her3/ErbB3)及其他相關(guān)受體的跨膜信號的異?；罨?］。CagL蛋白與整合素α5β1受體結(jié)合后，還能促使去整合素-金屬蛋白酶17從α5β1受體上解離下來，從而抑制HKα基因的表達(dá)，導(dǎo)致壁細(xì)胞無法分泌胃酸［8］，感染早期表現(xiàn)為一過性的胃酸分泌減少，隨著H.pylori定植面積的擴(kuò)大及感染時(shí)間的延長，黏膜炎癥加劇甚至發(fā)生癌變。

CagL蛋白分子內(nèi)除了RGD基序能同宿主細(xì)胞聯(lián)系外，新發(fā)現(xiàn)一段有功能的、在空間位置上同RGD基序毗鄰的序列——RGD助手序列(RGD helper sequence，RHS)。RHS基序能加強(qiáng)CagL與整合素受體的結(jié)合作用，并能與特定的整合素受體結(jié)合后啟動細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，因此，推測CagL分子內(nèi)至少存在兩種能與宿主細(xì)胞整合素受體結(jié)合的基序［9］。

已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用體外重組CagL純化蛋白免疫家兔后獲得抗CagL多克隆抗體血清，具有阻斷H.pylori對HeLa細(xì)胞黏附的作用，并導(dǎo)致促炎因子IL-8的分泌明顯減少［10］。另外將H.pylori用不同濃度的CagL多克隆抗體作用后與正常胃黏膜細(xì)胞GES-1進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力受到抑制，且轉(zhuǎn)入胞內(nèi)的CagA量隨抗體量的增加而降低［11］。但CagL抗體中和H.pylori作用的具體機(jī)制尚不清楚，推測可能是阻斷了CagL同宿主細(xì)胞整合素的識別，進(jìn)而阻礙了TFSS的成熟以及CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)。

本研究將CagL純化蛋白作為候選抗原制備了鼠源性的抗CagL單克隆抗體，最終獲得3株雜交瘤細(xì)胞株。鑒定結(jié)果表明3株抗體都具有較高的效價(jià)以及親和力，能夠特異性結(jié)合CagL融合蛋白，其中有兩株單抗能夠特異性結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床株的全菌蛋白，而有一株單抗未見特異性結(jié)合，其可能的原因在于用可溶性蛋白免疫得到的抗體可能無法識別變性蛋白的線性表位，或原核系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白同天然蛋白在構(gòu)象上存在差異。本研究為進(jìn)一步了解TFSS的黏附機(jī)制及其致病機(jī)制，深入探討CagL抗體的中和作用機(jī)制以及抗體對宿主細(xì)胞是否具有保護(hù)性作用等提供了依據(jù)。此外基于CagL抗原性、保守性、表面分布等特征，將抗CagL單克隆抗體作為H.pylori治療性疫苗以及應(yīng)用于臨床診斷，也有一定的價(jià)值。

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