王云飛，楊小明，李月英，李潔，黃炳忠，郭嬋元，易楠，刑朝暉

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;3.鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212028;4.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

銀杏酚和銀杏酸同為銀杏中存在的烷基酚類化合物，兩者結(jié)構(gòu)相近，均在苯環(huán)上連接有1個(gè)酚羥基和1個(gè)長(zhǎng)度為13到17碳的烷基側(cè)鏈，其差異僅為前者比后者在苯環(huán)上少連接1個(gè)羧基。兩者都存在于銀杏的葉、果和外種皮中，但銀杏酚的含量?jī)H為銀杏酸的1/10。由于烷基酚類化合物具有接觸性過敏特點(diǎn)，因此，國(guó)際上要求銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物(EGb761)中該類化合物的含量要低于1×10－5mg/g，甚至 5 ×10－6mg/g［1］。此外，銀杏酸還具有殺菌、殺蟲和抗腫瘤等活性作用，可進(jìn)一步研發(fā)為殺菌劑、殺蟲劑和抗腫瘤藥物［2－5］。目前，人們對(duì)銀杏烷基酚類化合物的研究主要局限于銀杏酸，而對(duì)銀杏酚的研究并不多。本課題組在前期對(duì)銀杏酸研究的基礎(chǔ)上，制備出銀杏酚同系物并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定［6］，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究銀杏酚對(duì)體外SMMC-7721肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)體內(nèi)荷H22肝癌小鼠瘤體生長(zhǎng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 銀杏酚按照文獻(xiàn)［6］制備并鑒定，由銀杏酚 C13∶0，C15∶0，C15∶1，C17∶1和C17∶2等5個(gè)同系物組成，含量大于95%。DMEM和 RPMI1640、胎牛血清購(gòu)自 Gibco公司;MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;藥物注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)購(gòu)自通化茂祥制藥有限公司，批號(hào):111101。其余試劑均為分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)，使用前未再進(jìn)行處理。

1.1.2 腫瘤細(xì)胞株 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞所提供，江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院凍存;小鼠肝癌H22瘤株由蘇州大學(xué)惠贈(zèng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào):SCXK(蘇)2009-0002。獨(dú)立隔離飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為(20±1)℃，濕度60% ～70%，每天自然光照12 h，自由進(jìn)食，飲水。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 電子分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)，MQX200型紫外可見光全自動(dòng)掃描酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK公司)，ABX PENTRA60血液分析儀，SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，F(xiàn)orma CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Sicentific公司)，Tomos 900B臺(tái)式離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司)，XD-202倒置式生物顯微鏡及數(shù)碼攝像系統(tǒng)(江南儀器)，PYX-DHS-40X50B隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，ULT1386-3-V40超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scientific Revco公司)，TH-3560高壓滅菌鍋［造鑫(鑫科)企業(yè)有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞株用DMEM常規(guī)傳代培養(yǎng);H22肝癌細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)。2種細(xì)胞培養(yǎng)液中均含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 銀杏酚對(duì)SMMC-7721細(xì)胞抑制作用 采用MTT法［7］測(cè)定銀杏酚對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104/mL，混勻，于 96 孔板加細(xì)胞懸液 100 μL/孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同質(zhì)量濃度的銀杏酚處理24、48和72 h后，每孔加入10 μL 5 g/L的MTT(PBS)溶液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)避光孵育4 h，小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，輕微振蕩10 min后，于酶標(biāo)儀上測(cè)570 nm處光密度，每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔，平行測(cè)定3次。按下面公式計(jì)算抑制率，SPSS 16.0軟件計(jì)算銀杏酚的半數(shù)抑制濃度IC50。抑制率=(對(duì)照組光密度值－治療組光密度值)/(對(duì)照組光密度值－空白組光密度值)×100%。

1.2.3 銀杏酚對(duì)小鼠H22腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用參照文獻(xiàn)［7］方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H22細(xì)胞無(wú)菌腹腔注射小鼠，以小鼠腹腔積液傳代，每7天傳1代。選擇第2代生長(zhǎng)旺盛，且無(wú)潰破的健康H22荷瘤小鼠，頸椎脫位法處死小鼠，于超凈工作臺(tái)無(wú)菌抽取乳白色腹腔積液，用無(wú)菌生理鹽水1∶3稀釋后接種于健康小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2 mL。

于接種次日隨機(jī)分組，每組8只，雌雄各半。設(shè)不接種腹腔積液的小鼠為正常對(duì)照組。小鼠接種24 h后，銀杏酚處理組于腹腔注射不同質(zhì)量濃度的銀杏酚(分別為20，40，80和160 mg/kg);環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺(2 mg/kg)，作為陽(yáng)性對(duì)照;模型對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，0.2 mL/只;1次/d，均連續(xù)注射7 d。于末次給藥后24 h(禁食不禁水)，分別稱重，眼眶取血于抗凝管中用于血細(xì)胞計(jì)數(shù);然后迅速頸椎脫臼處死小鼠，剝離瘤體、脾臟和胸腺，分別稱重，并按下面公式計(jì)算抑瘤率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g);脾指數(shù)=脾質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g);抑瘤率=［對(duì)照組小鼠平均瘤質(zhì)量(g)－用藥組小鼠平均瘤質(zhì)量(g)/對(duì)照組小鼠平均瘤質(zhì)量(g)］×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)和百分?jǐn)?shù)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏酚對(duì)體外SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用

分別測(cè)定了不同質(zhì)量濃度銀杏酚處理SMMC-7721細(xì)胞24、48和72 h對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，見圖1。

由圖1a可見，在0～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，銀杏酚對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用顯著增強(qiáng)，質(zhì)量濃度與抑制率呈正相關(guān)，質(zhì)量濃度-抑制率曲線呈現(xiàn)出一段陡的直線;銀杏酚質(zhì)量濃度為50～100 mg/L時(shí)，質(zhì)量濃度變化對(duì)SMM-7721抑制率無(wú)明顯影響，質(zhì)量濃度-抑制率曲線出現(xiàn)一小平臺(tái);銀杏酚質(zhì)量濃度為200～400 mg/L時(shí)，細(xì)胞抑制率與質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。因此，將銀杏酚的質(zhì)量濃度范圍調(diào)整為0～30 mg/L。圖1b為銀杏酚質(zhì)量濃度為0～30 mg/L時(shí)處理SMMC-7721細(xì)胞24，48和72 h后的生長(zhǎng)抑制率曲線。由圖1b可見，SMMC-7721細(xì)胞的抑制率隨著銀杏酚質(zhì)量濃度的增加而顯著增加。以質(zhì)量濃度為15 mg/L的銀杏酚處理SMMC-7721細(xì)胞72 h，抑制率已接近100%。銀杏酚作用于 SMMC-7721細(xì)胞24、48和72 h的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度 IC50分別為(15.33±1.19)、(12.20 ±1.08)和(10.88 ±1.03)mg/L。結(jié)果表明，銀杏酚對(duì)體外SMMC-7721肝癌細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，并呈明顯的量效和時(shí)效正相依賴關(guān)系。

圖1 銀杏酚對(duì)體外人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的抑制作用Fig 1 Inhibitory effects of ginkgols on SMMC-7721 cells in human hepatic carcinoma cell lines

2.2 銀杏酚對(duì)小鼠H22腫瘤生長(zhǎng)的影響

結(jié)果見表1，銀杏酚20 mg/kg組(P=0.83)和40 mg/kg組(P=0.14)的小鼠體質(zhì)量與模型對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但存活率遠(yuǎn)高于模型對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組(P均＜0.05)。銀杏酚20 mg/kg組(P ＜0.01)和 160 mg/kg組(P=0.027)的抑瘤率明顯低于環(huán)磷酰胺組;而40 mg/kg組的抑瘤率與環(huán)磷酰胺組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.667);80 mg/kg組的抑瘤率明顯高于環(huán)磷酰胺組(P=0.048);由此可以看出，銀杏酚體內(nèi)的抑瘤作用與體外對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，即隨著劑量的增加，抑瘤率逐漸增大;劑量過高抑瘤率反而有所下降。綜合銀杏酚對(duì)小鼠體質(zhì)量、存活率、抑瘤率的影響，其劑量為40 mg/kg時(shí)效果最好。

表1 各組小鼠的基本情況比較±sTab 1 Comparison of basic values in different groups

表1 各組小鼠的基本情況比較±sTab 1 Comparison of basic values in different groups

a∶P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較;b∶P ＜0.05，與環(huán)磷酰胺組比較

/%模型對(duì)照組 24.28 ±0.74 50.00 0.540 5 ±0.016 2組別 體質(zhì)量/g 存活率/% 瘤質(zhì)量/g 抑瘤率—環(huán)磷酰胺組 28.78 ±1.71a 62.50 0.308 4 ±0.090 4a 42.94銀杏酚組 20 mg/kg 24.12 ±1.20 75.00 0.492 1 ±0.042 9b 8.96b 40 mg/kg 25.68 ±1.54 82.50 0.325 3 ±0.030 9a 39.81 80 mg/kg 19.83 ± 0.35a 75.00 0.278 3 ±0.022 7a，b 48.51b 160 mg/kg 22.22 ± 1.16 50.00 0.387 2 ±0.028 8a，b 28.36b F/χ2 值 3.48 42.26 3.86 44.82 P值0.99 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 銀杏酚對(duì)荷H22小鼠免疫器官指數(shù)及免疫細(xì)胞數(shù)的影響

與模型對(duì)照組比較，銀杏酚4個(gè)組的胸腺指數(shù)均明顯降低(P均＜0.05)。就脾指數(shù)而言，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的比較±sTab 2 Comparison of spleens index and thymus index in different groups

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的比較±sTab 2 Comparison of spleens index and thymus index in different groups

a:P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較;b:P ＜0.05，與環(huán)磷酰胺組比較

組別 胸腺指數(shù) 脾指數(shù)模型對(duì)照組6.52 ±0.42 5.64 ±1.22環(huán)磷酰胺組 3.81 ±0.32a 6.47 ±1.03銀杏酚組 20 mg/kg 4.75 ±0.39a 6.04 ±1.15 40 mg/kg 2.06 ±0.18a，b 6.29 ± 0.91 80 mg/kg 0.60 ±0.09a，b 7.21 ± 1.05 160 mg/kg 0.67 ±0.13a，b 4.89 ± 0.45 F 值 4.311 0.029 P值 ＜0.01 0.251

銀杏酚治療后荷瘤小鼠外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)如圖2所示。

圖2 各組小鼠的外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(×109/L)Fig 2 Comparison of lymphocyte levels from peripheral blood in different groups

模型對(duì)照組淋巴細(xì)胞數(shù)略低于環(huán)磷酰胺組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.860，P ＞0.05);較正常組有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.346，P ＜0.05)。銀杏酚組淋巴細(xì)胞數(shù)與模型對(duì)照組、正常對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組比較，均有明顯升高(P均＜0.05);其中，以 40 mg/kg和 80 mg/kg組 尤 為 明 顯(P＜0.01)，說明不同質(zhì)量濃度的銀杏酚能不同程度地增加外周血中的淋巴細(xì)胞數(shù)，提高荷瘤小鼠的免疫功能。

3 討論

銀杏酚是銀杏葉、果和外種皮中存在的天然活性成分。本研究采用MTT法研究了銀杏酚對(duì)體外SMMC-7721細(xì)胞活性的影響。分別從時(shí)間和劑量關(guān)系兩個(gè)方面比較了銀杏酚對(duì)體外SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。銀杏酚作用SMMC-7721細(xì)胞24、48和72 h 的 IC50分別為(15.33 ±1.19)，(12.20 ±1.08)、(10.88 ±1.03)mg/L。結(jié)果表明，在 0 ～30 mg/L范圍內(nèi)，銀杏酚對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，并呈明顯的量效和時(shí)效正相關(guān)。銀杏酚質(zhì)量濃度過高對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制率反而下降。

為進(jìn)一步證實(shí)銀杏酚對(duì)體內(nèi)肝癌實(shí)體瘤的抑制作用，本研究建立H22荷瘤小鼠模型，分別用20，40，80和160 mg/kg的銀杏酚治療荷瘤模型。結(jié)果表明，銀杏酚對(duì)小鼠體內(nèi)H22實(shí)體瘤有一定的抑制作用，在20～80 mg/kg范圍內(nèi)，呈現(xiàn)劑量與效果的依賴關(guān)系，但質(zhì)量濃度達(dá)到160 mg/kg時(shí)，抑制率反而下降。體內(nèi)抑瘤作用與體外抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)作用呈現(xiàn)相同的倒“U”形趨勢(shì)。綜合抑瘤率、存活率、體質(zhì)量變化以及荷瘤小鼠日常精神狀態(tài)，銀杏酚體內(nèi)治療H22荷瘤小鼠的最適劑量為40 mg/kg。

此外，銀杏酚組的H22荷瘤小鼠胸腺指數(shù)隨著藥物質(zhì)量濃度的增加逐漸減小。胸腺是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官之一，正常情況下會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸減小。本研究中銀杏酚組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)的降低可能是由銀杏酚促進(jìn)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及胸腺內(nèi)成熟引起的［8］。從脾指數(shù)變化可看出，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

通過檢測(cè)銀杏酚治療荷瘤小鼠后其外周血淋巴細(xì)胞數(shù)的變化(圖2)發(fā)現(xiàn)，銀杏酚對(duì)荷瘤H22小鼠的免疫系統(tǒng)不僅沒有明顯的不良反應(yīng)，而且還能顯著提高荷瘤小鼠的免疫功能，表現(xiàn)為荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)的顯著升高。由于淋巴細(xì)胞在腫瘤治療過程中發(fā)揮著重要作用［9－10］，相對(duì)于 Ben-Efraim［10］和李墨林［11］對(duì)抗腫瘤藥物的分類，銀杏酚很可能是依賴于T淋巴細(xì)胞的抗腫瘤藥物。大劑量藥物通常對(duì)機(jī)體的免疫功能起抑制作用，相比之下，小劑量藥物可激活或提高機(jī)體的抗腫瘤免疫力［10－11］?；蛟S銀杏酚可作為一種小劑量抗腫瘤輔助藥物。

銀杏酚酸具有廣泛的生物活性，目前國(guó)內(nèi)銀杏葉制劑和銀杏保健食品等已有市面產(chǎn)品。但不可忽視的是，烷基酚酸類化合物在表現(xiàn)出理想的生物活性的同時(shí)，如抑菌、抗腫瘤等，還有一定的致敏及細(xì)胞毒作用［12］。如何在保證在安全劑量范圍內(nèi)，最大限度地利用銀杏酚酸的生物活性，還有待于深入研究。本文中初步闡述了銀杏酚的抗腫瘤作用，能否在臨床上發(fā)揮良好效果，還有待于進(jìn)一步研究。

［1］ van Beek TA.Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts［J］.J Chromatogr，2002，967(1):21 －55.

［2］ 楊小明，陳鈞，錢之玉，等.銀杏酸抑菌效果的初步研究［J］.中藥材，2002，25(9):651－653.

［3］ 楊小明，陳盛霞，張蓉仙，等.銀杏外種皮石油醚提取物的殺釘螺活性研究［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22(10):961 －964.

［4］ 楊小明，陳永昌，陳鈞.銀杏中銀杏酸誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞 U937凋亡的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(9):241－246.

［5］ 葉思思，高靜，龔愛華，等.線粒體參與銀杏酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的研究［J］.南京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012，48(3):360－366.

［6］ 楊小明，劉方，龔愛華.一種白果酚的制備方法:中國(guó)，CN200810234282.6［P］.2009-08-26.

［7］ 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:181－190，1758－1786.

［8］ 侯元，霍德勝，魏艷君，等.草蓯蓉多糖的抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，33(6):1022－1025.

［9］ 李墨林，李傳剛，舒曉宏，等.化療治愈荷瘤小鼠模型的建立及氟尿嘧啶抑制瘤作用的免疫機(jī)制［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23(11):1010－1013.

［10］ Ben-Efraim S.Immunomodulating anticancer alkylating drugs:targets and mechanisms of activity［J］.Curr Drug Targets，2001，2(2):197 －212.

［11］ 李墨林.化療治愈腫瘤動(dòng)物模型的建立及小劑量CTX抗腫瘤作用機(jī)制的研究［D］.遼寧:大連醫(yī)科大學(xué)，2008.

［12］ 楊小明，陳鈞，錢之玉.烷基酚酸的生物活性研究進(jìn)展［J］.中草藥，2003，34(5):5 －6.