韓堯輝，潘皓，毛俊倩，周艷芳，張贏予，王好，鮑永輝，趙龍，劉玲玲，張國輝

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002)

多柔比星(doxorubicin，DOX)是一種廣譜抗腫瘤藥物，長期應(yīng)用可引起心臟毒性，進而引起不可逆轉(zhuǎn)的心肌損傷和心功能障礙［1］。研究表明多柔比星引起的心臟毒性與心肌細胞的凋亡密切相關(guān)。S100B作為一種多功能鈣敏感蛋白，在生理條件下，心肌細胞幾乎不表達。有研究表明S100B可以直接引起心肌細胞凋亡［2］。本實驗通過建立多柔比星損傷心肌細胞模型，研究S100B在心肌細胞損傷時的表達變化;通過RNA干擾技術(shù)沉默S100B基因，研究S100B在多柔比星誘導(dǎo)心肌細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1日齡新生SD大鼠，雌雄不限，由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供。S100B siRNA:上游序列5'-CCGGGAACUAUUGAUAAGATT-3'，下游序列 5'-UCUUAUCAAUAGUUCCCGGTT-3';陰性對照siRNA:上游序列5'-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3'，下游序列5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'皆由上海吉瑪公司合成。脂質(zhì)體RNAi-MAX購自美國Invitrogen公司。鹽酸多柔比星購自美國Enzo公司，DMEMF-12培養(yǎng)基、MTT均購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，多聚賴氨酸、RIPA裂解液(強)、PMSF均購自碧云天生物科技公司，α-橫紋肌肌動蛋白(αsarcomericactin，α-SA)、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自南京厚載生物科技有限公司，S100B(D10G6)兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling，單克隆β-肌動蛋白購自北京四正柏生物科技有限公司，山羊抗兔、抗小鼠IgG、免疫印跡高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。其余生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 取出生1 d的SD乳鼠，75%的乙醇消毒2次，無菌條件下開胸取出心臟，置于預(yù)冷的PBS中吹打清洗2次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，加入5倍體積0.08%的胰酶于37℃水浴箱振蕩消化5 min，收集除第1次外的細胞懸液，置于含20%胎牛血清的DMEMF-12培養(yǎng)基中終止消化。重復(fù)上述過程，直至組織塊完全消化，最后離心、重懸、200目濾網(wǎng)過濾、接種，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)1.5 h，純化心肌細胞。按密度為1×106接種在6孔板中，孵育箱中靜置培養(yǎng)，待用。

1.2.2 心肌細胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 于倒置相差顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)學(xué)變化及搏動情況并拍照;培養(yǎng)72 h的心肌細胞，PBS清洗3次，4%的低聚甲醛固定后，用α-SA做免疫組化進行純度鑒定，鏡下隨機取20個視野，每個視野20個細胞，計算心肌細胞比例。

1.2.3 分組及轉(zhuǎn)染 體外分離培養(yǎng)心肌細胞，選取生長狀態(tài)好的隨機分為4組:對照組為正常心肌細胞，不做任何處理;DOX組:加入2 μmol/L多柔比星處理2 h;DNC組:轉(zhuǎn)染陰性siRNA，加入多柔比星(2 μmol/L)處理2 h;DSB組:轉(zhuǎn)染特異性 S100B-siRNA，加入多柔比星(2 μmol/L)處理 2 h。按照Invitrogen脂質(zhì)體RNAi-MAX說明，轉(zhuǎn)染前24 h換用無血清DMEMF-12培養(yǎng)基，于細胞融合度為80%時進行轉(zhuǎn)染。取100 μL DMEMF-12稀釋5 μL siRNA，輕輕混勻，100 μL DMEMF-12 與6 μL 的脂質(zhì)體RNAi-MAX輕輕混勻，最后將兩者混合物等體積混勻，輕柔吹打幾次，室溫孵育15 min。將200 μL的混合液呈滴狀滴加在6孔板中，混勻。最終siRNA濃度為100 nmol/L。置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后，換含有10%胎牛血清的DMEMF-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)液，DOX組、DNC組和DSB組分別加入終濃度為2 μmol/L的多柔比星處理2 h。

1.2.4 MTT檢測細胞存活率 心肌細胞按1×105接種于96孔板中，待細胞融合度達80%時，按上述方法進行轉(zhuǎn)染，以不做任何處理的心肌細胞作為對照組，每組設(shè)4個復(fù)孔，空白孔調(diào)零。每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃ 孵育 4 h，棄每孔上清，加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀(490 nm)檢測各孔光密度(D)值。心肌細胞存活率=(處理組D值-空白孔D值)/(對照組D值-空白孔D值)×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測凋亡率 將處理后的心肌細胞用胰酶消化、離心收集。預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)整密度為1×106/mL;取100 μL的細胞懸液加入5 μL的Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光孵育15 min;再加10 μL PI輕輕混勻于4℃避光孵育5 min;最后加入300 μL的結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)流式細胞儀檢測，以百分?jǐn)?shù)表示凋亡率。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡檢測S100B蛋白 處理后的心肌細胞用預(yù)冷的PBS清洗3次，細胞刮刮取細胞，4℃，5 000 r/min，離心5 min，收集細胞團，加入RIPA裂解液(含 PMSF)冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，離心20 min，收集上清液即為總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100℃變性5 min，上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣約為40 μg，電泳結(jié)束后將蛋白印跡到硝酸纖維膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，最后ECL顯影。采用Image-proplus軟件分析蛋白條帶D值，以靶蛋白D值與β-肌動蛋白D值的比值反應(yīng)靶蛋白相對水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，計量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定

剛分離的心肌細胞呈球形，培養(yǎng)4 h細胞開始貼壁生長，逐漸由圓形變?yōu)樗笮?，并開始伸出偽足，后變?yōu)槿切?、多邊形等。培養(yǎng)72 h后細胞伸出偽足相互交織成網(wǎng)，逐漸形成細胞簇或細胞單層，搏動呈同步性，搏動頻率為65～150次/min，見圖1。培養(yǎng)72 h的心肌細胞進行α-SA鑒定，細胞質(zhì)呈棕黃色即為陽性，結(jié)果顯示心肌細胞純度可達90%。見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)后的心肌細胞(×200)Fig 1 Cultured cardiomyocytes isolated from 1d SD rats

圖2 α-SA免疫化學(xué)染色鑒定原代心肌細胞純度(×400)Fig 2 Purity of cardiomyocytes evaluated by immunocytochemical staining with α-SA

2.2 各組心肌細胞存活率比較

MTT檢測結(jié)果表明，DNC組心肌細胞存活率與DOX組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與DOX組相比，DSB組存活率上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.48，P ＜0.05)。見表1。

2.3 各組心肌細胞凋亡率比較

流式細胞術(shù)分析表明，DNC組心肌細胞凋亡率與DOX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與DOX組相比，DSB組凋亡率降低(t=0.76，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3，表1。

2.4 各組心肌細胞S100B蛋白表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測S100B蛋白表達結(jié)果顯示，DNC組與DOX組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與DOX組相比，DSB組蛋白表達明顯降低(t=1.82，P ＜0.01)。見圖4，5。

圖3 流式細胞術(shù)檢測心肌細胞凋亡率Fig 3 Apoptosis rate determined by flow cytometry

表1 各組心肌細胞存活率和凋亡率Tab 1 Survival rate and apoptosis rate of cardiomyocytes from different groups

圖4 蛋白質(zhì)印跡檢測心肌細胞S100B蛋白表達Fig 4 The results of S100B protein expression evaluated by Western blotting

圖5 各組心肌細胞S100B表達比較Fig 5 S100B protein expression in different groups

3 討論

多柔比星是一種蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素，廣泛應(yīng)用于多種腫瘤性疾病的治療，由于該藥存在心臟毒性并呈現(xiàn)劑量依賴性［3］，從而限制了其臨床應(yīng)用。目前，對于多柔比星心臟毒性的機制仍不明確，普遍認(rèn)為，活性氧自由基、線粒體損傷、鈣超載、脂質(zhì)過氧化、心肌細胞凋亡為其重要環(huán)節(jié)，隨著進一步的研究，多柔比星導(dǎo)致的心肌細胞凋亡成為新的研究熱點［4］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞的凋亡是多柔比星心臟毒性最為直接的表現(xiàn)形式之一［5］。多柔比星誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的具體機制目前主要集中在Fas/FasL途徑、線粒體途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、p53途徑等。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是由基因控制的細胞主動死亡形式。細胞外部的因素，可通過影響這些基因的表達，實現(xiàn)對凋亡的調(diào)控。在多柔比星引起的心臟毒性中，細胞凋亡發(fā)揮著極為重要的作用，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，多柔比星處理過的心肌組織存在著大量凋亡的細胞。S100B是S100蛋白家族的一員，是一種新型的鈣敏感結(jié)合蛋白，在正常的心肌細胞中不表達［6］。近幾年通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，S100B的過度表達能夠引起心肌細胞凋亡，導(dǎo)致心梗小鼠梗死面積擴大［2］。在培養(yǎng)的心肌細胞中，加入外源性的S100B可以引起心肌細胞凋亡，并呈劑量依賴性，起始劑量為 100 nmol/L［7］。S100B有可能是與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)相互作用進而激活 ERK1/2和 p53［7］，導(dǎo)致細胞色素C釋放以及激活了預(yù)凋亡胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)(已經(jīng)在N18神經(jīng)母細胞瘤細胞中證實)［8］，從而引起心肌細胞凋亡。此外，在細胞內(nèi)S100B也有可能通過激活誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和產(chǎn)生一氧化氮(NO)，從而調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡［9］，這一現(xiàn)象已經(jīng)在星形細胞中證實［10］。

本實驗建立多柔比星損傷模型，觀察S100B蛋白的表達變化及其作用。結(jié)果表明，S100B在正常心肌細胞中不表達，多柔比星誘導(dǎo)凋亡的心肌細胞中表達明顯增加;多柔比星干預(yù)后的心肌細胞存活率降低，凋亡率升高。用脂質(zhì)體RNAi-MAX轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠心肌細胞后，與DOX組相比，DSB組心肌細胞凋亡率降低，S100B蛋白表達明顯受到抑制。這說明S100B在多柔比星誘導(dǎo)心肌細胞凋亡中起促進作用。

綜上所述，S100B可能是多柔比星誘導(dǎo)心肌細胞凋亡的重要途徑之一，可作為對多柔比星心臟毒性進一步探索的靶點。

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