門 楠 夏春波 孫婧霞 蔣常文

(唐山市婦幼保健院病理科，河北 唐山 063000)

研究表明，阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病早期即可出現(xiàn)突觸及神經(jīng)元的大量丟失，中期病人的內(nèi)嗅區(qū)皮質(zhì)中神經(jīng)元丟失達(dá)50%，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元的丟失機(jī)制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔1〕。β-淀粉樣蛋白(Aβ)有局部神經(jīng)毒性〔2〕，是 AD患者腦中產(chǎn)生老年斑的主要成分，注射β-淀粉樣蛋白是最常用的一種建立AD動物模型的方法。X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有細(xì)胞凋亡抑制作用的新蛋白，經(jīng)研究〔3〕，其融合蛋白TAT-XIAP可以透過血腦屏障，為治療神經(jīng)退行性疾病提供了新靶點(diǎn)。本研究通過構(gòu)建AD大鼠模型來觀察TAT-XIAP融合蛋白對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善的作用，為AD治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 4～5月齡，250～300 g健康雄性SD大鼠30只，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 動物隨機(jī)分成3組:空白對照組、AD模型組與治療組各10只。空白對照組大鼠海馬區(qū)注射等量生理鹽水，AD模型組與治療組大鼠海馬區(qū)注射Aβ(25～35)。

1.3 主要藥物、試劑儀器 藥物TAT-XIAP融合蛋白(本實(shí)驗(yàn)室研究合成提供)、Aβ(25～35)(Sigma公司)、牙托粉(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科提供)、10%水合氯醛、青霉素。腦立體定位儀(日本NARISHIGE型)、Morris水迷宮(桂林醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室制作)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物篩選及喂養(yǎng) 適應(yīng)環(huán)境1 w后，以Morris水迷宮法篩選學(xué)習(xí)記憶功能正常大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有動物在統(tǒng)一條件下(室溫19～24℃，相對濕度40%左右)普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，每周稱體重，觀察精神狀態(tài)、神經(jīng)行為。

1.5 AD大鼠模型的制備 將Aβ(25～35)溶于生理鹽水中，濃度5 g/L，37℃孵育7 d，轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂瘧B(tài)的Aβ(25～35)，4℃貯存?zhèn)溆?。將大鼠?0%水合氯醛(30 mg/kg，ip)麻醉，頭頂部去毛并將頭部固定于立體定位儀上，頭頂部消毒，在顱頂中部作一縱向切口，暴露顱骨，參照文獻(xiàn)〔4〕的《大鼠腦立體定位圖譜》，以前囟定位，坐標(biāo)為前囟后(CA)3.8 mm，中線左右旁開(ML)2 mm，硬膜下(DV)2.8 mm，鉆開顱骨，用微量進(jìn)樣針垂直注射Aβ(25～35)，每側(cè)注射2μl(5 g/L)，在5 min之內(nèi)注射完畢并留針5 min，使Aβ(25～35)充分彌散，緩慢撤針，用牙托粉填補(bǔ)顱骨鉆孔，局部消毒后縫合頭皮，術(shù)后肌注青霉素8萬U抗感染，保溫至動物清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 給藥方法 模型建立后6 w開始給藥，模型治療組經(jīng)尾靜脈注射TAT-XIAP融合蛋白(10 mg/kg)，空白對照組與模型組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水，每周兩次，連續(xù)4 w。

1.7 Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 造模前，給藥前及造模結(jié)束后，均進(jìn)行Morris水迷宮測試。每組大鼠在造模前均進(jìn)行水迷宮游泳訓(xùn)練，訓(xùn)練至整個(gè)游泳從起始到找到平臺所用時(shí)間連續(xù)3次都小于120 s為獲得記憶。1 w后在同一時(shí)間點(diǎn)上再重新進(jìn)行水迷宮游泳實(shí)驗(yàn)，大鼠尋找并爬上平臺所需要的時(shí)間為逃避潛伏期。水迷宮實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求安靜，避免一切外界干擾，室內(nèi)日光燈照明，水溫25℃左右，時(shí)間一般選在13:00～17:00，19:00～21:00，共3次，計(jì)算平均成績。

2 結(jié)果

2.1 游泳軌跡路線圖 圖1為各組多數(shù)大鼠在Morris水迷宮中游泳的軌跡路線圖。按順時(shí)針方向?qū)⑺詫m分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個(gè)象限，平臺所在象限為第Ⅰ象限，第Ⅲ象限為入水點(diǎn)。由大鼠morris水迷宮游泳軌跡路線圖得知，鹽水組大鼠游泳的軌跡路線多呈直線型;模型組大鼠游泳的軌跡路線多呈隨機(jī)型或邊緣型，軌跡雜亂無章，反映了造模后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降;經(jīng)TAT-XIAP治療后大鼠游泳的軌跡路線多在平臺所在象限附近，呈趨向型，說明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較模型組提高。

圖1 各組游泳軌跡線圖

2.2 逃避潛伏期結(jié)果 造模后，模型組與AD治療組大鼠均較鹽水組大鼠逃避潛伏期延長(P＜0.05);模型組與AD治療組大鼠造模后較造模前逃避潛伏期延長(P＜0.05)，反映了造模后大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的下降。治療組大鼠治療后較治療前潛伏期縮短(P＜0.05)。對照組造模前后潛伏期無差異(P＞0.05)。見表1。

表1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測逃避潛伏期結(jié)果(n=10

表1 Morris水迷宮行為學(xué)檢測逃避潛伏期結(jié)果(n=10

與對照組比較:1)P＜0.05;與造模前比較:2)P＜0.05;與治療前比較:3)P＜0.05

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3 討論

近年來，關(guān)于AD動物模型的研究人們提出了不同的假說，開展了多種動物模型的研制與應(yīng)用。Aβ是AD人腦內(nèi)老年斑的主要成分，能仿真產(chǎn)生神經(jīng)纖維纏結(jié)，誘導(dǎo)神經(jīng)元退行性變和學(xué)習(xí)記憶能力障礙。因而腦內(nèi)注射聚合態(tài)Aβ可以建立作為AD 研究的動物模型〔4，5〕。

Morris水迷宮是用來衡量動物學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)手段，能夠有效地反映動物的認(rèn)知功能改變〔6〕，是評價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠認(rèn)知水平能力(障礙或改善程度)的一種行為學(xué)模式，已被廣泛地應(yīng)用于動物學(xué)習(xí)記憶功能研究中。

本研究結(jié)果表明TAT-XIAP對大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用。研究顯示XIAP具有強(qiáng)大的抗凋亡作用，有望成為治療神經(jīng)退行性疾病、腦缺血等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥〔7，8〕。TAT-XIAP融合蛋白經(jīng)靜脈注射能夠順利進(jìn)入大腦皮層細(xì)胞，并能顯著抑制Caspase的活性，降低腦缺血梗死灶的面積〔9〕。本研究推測XIAP可能起到了抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)的作用，為治療老年性癡呆提供了新的思路。

1 Carlos EP，Petar P，Noemi V，et al.Pro-NGF isolated from the human brain affected by alzheimer's disease induces neuronal apoptosis mediated by p75NTR〔J〕.Am J Pathol，2006;166(2):533-43.

2 Lesne S，Koh MT，Kotilinek I，et al.A specific amyloid-β protein assembly in the brain impairs memory〔J〕.Nature，2006;440(7082):352-7.

3 張曉紅，蔣常文，夏春波，等.融合蛋白pTAT-XIAP的原核表達(dá)及穿透血腦屏障功能的鑒定〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(5):806-8.

4 呂 誠，胡小令，祝高春，等.β-淀粉樣蛋白所致老年性癡呆動物模型的建立〔J〕.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005;45(1):28-9.

5 劍 非，陳 紅，任常山，等.β-淀粉樣蛋白腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病大鼠模型〔J〕.中國神經(jīng)精神病雜志，2005;31(2):145-7.

6 Pan YF，Chen XR，Wu MN，et al.Arginine vasopressin prevents against Abeta(25-35)-induced impairment of spatial learning and memory in rats〔J〕.Horm Behav，2010;57(4-5):448-54.

7 Tsang AH，Lee YI，Ko HS，et al.S-nitrosylation of XIAP compromises neuronal survival in Parkinson's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009;106(12):4900-5.

8 Askalan R，Salweski R，Tuor UI，et al.X-linked inhibitor of apoptosis protein expression after ischemic injury in the human and rat developing brain〔J〕.Pediatr Res，2009;65(1):21-6.

9 Guegan C，Braudeau J，Couriaud C，et al.PTD-XIAPprotects against cerebral ischemia by anti-apoptotic and transcriptional regulatory mechanisms〔J〕.Neurobiol Dis，2006;22(1):177-86.