徐水凌，徐 妍，黃 佳，范宏彥，金夢(mèng)媚

(1.嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，浙江 嘉興 314001;2.遵義醫(yī)學(xué)院·珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的人類重大傳染病之一。我國也是22個(gè)結(jié)核病高發(fā)病率國家之一，其中活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。在MTB感染早期，侵入的宿主細(xì)胞主要為樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞［1-3］，因此，了解MTB如何侵入機(jī)體樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，對(duì)闡明結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制尤為重要。有研究表明，病原菌如沙門菌及致病性大腸埃希菌等粘附宿主細(xì)胞后，可激活胞內(nèi)磷脂酶C(phospholisae C，PLC)信號(hào)分子，促使胞內(nèi)Ca2+濃度增加，觸發(fā)微絲肌動(dòng)蛋白(F-actin)細(xì)胞骨架重排，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)化入細(xì)胞［4-5］。MTB感染DC過程中，細(xì)胞PLC分子是否被激活，細(xì)胞骨架(微絲、微管)是否有重排至今尚末有報(bào)道。在本研究中，我們采用小鼠骨髓來源的成熟細(xì)胞系DC2.4作為人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株侵入的靶細(xì)胞，建立了人結(jié)核分枝桿菌 H37Rv株DC2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)模型，檢測(cè)了H37Rv株侵入DC2.4細(xì)胞時(shí)細(xì)胞骨架(微絲、微管)的變化情況，并采用PLC分子特異性阻斷劑U73122抑制DC2.4細(xì)胞的PLC分子，觀察H37Rv株侵入率變化以及對(duì)細(xì)胞骨架變化的影響，這將為深入闡明結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制及抗感染免疫的研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、細(xì)胞株及主要試劑 人結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv株(mycobacterium tuberculosis H37Rv)，由本實(shí)驗(yàn)室采用改良羅氏固體培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)并保存。小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4細(xì)胞株(為成熟的DC)由浙江大學(xué)免疫研究所惠贈(zèng)，以含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DEME培養(yǎng)液在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。鼠來源抗β-微管蛋白(Beat-tubulin)單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠IgG、四甲基異硫氰酸羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Palloidin-TRITC)、牛血清蛋白(BSA)、磷脂酶C特異性抑制劑 U73122(美國Sigma公司)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、小鼠磷脂酶C分子檢測(cè)試劑盒(美國R＆D公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和人結(jié)核分枝桿菌H37Rv懸液制備 小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和鏈霉素)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，小心吹打細(xì)胞，然后以無菌 PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗3次(1500 r/min離心10 min)，最后調(diào)整細(xì)胞濃度至5.2×105個(gè)/ml。將人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株接種于改良羅氏固體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃孵育3周后，挑取生長(zhǎng)良好的H37Rv株于磨菌器中，加入含體積分?jǐn)?shù)為0.05%Tween-80的生理鹽水液研磨15 min，無菌PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗2次(2500 r/min離心10 min)，將其重懸于不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，調(diào)整其細(xì)菌濃度為4.3×107CFU/ml，備用。

1.3 H37Rv株與DC2.4細(xì)胞混合培養(yǎng) 取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔置一蓋玻片(0.8 cm×0.8 cm)，分別接種 DC2.4細(xì)胞(5.2×105個(gè)/ml)各1 ml，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育至細(xì)胞呈單層狀。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入2 ml DMEM培養(yǎng)液中(無抗生素，含10%胎牛血清)，分別孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液，按細(xì)菌∶細(xì)胞=80∶1的比例，每孔加入H37Rv株懸液1 ml(濃度為4.3 ×107CFU/ml)，37℃分別孵育 0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)，用PBS沖洗3次，取出蓋玻片，以－20℃預(yù)冷的細(xì)胞固定液固定3 min，PBS洗2次，Giemsa染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。另取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按上述相同方法分別進(jìn)行H37Rv和DC2.4細(xì)胞株以及U73122(終濃度為10 μmol/L)預(yù)處理30 min的DC2.4細(xì)胞株混合培養(yǎng)，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h 時(shí)去除細(xì)胞培養(yǎng)板上的細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔再以PBS小心沖洗5次，然后分別加入250 μl 0.1%Triton X-100于37℃ 裂解細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察DC2.4細(xì)胞的裂解情況，待細(xì)胞全部裂解后每孔加入RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，無抗生素)500 μl，混勻后每孔分別做 1∶10和1∶100稀釋后接種于羅氏培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18 d，計(jì)數(shù)各時(shí)間點(diǎn) H37Rv菌落總數(shù)(CFU)，同時(shí)計(jì)算不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌侵入率。細(xì)菌侵入率(%)=不同混合培養(yǎng)時(shí)間的H37Rv菌落總數(shù) /混合培養(yǎng)前H37Rv菌落總數(shù) × 100%［6］。

1.4 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞微絲變化 將DC2.4細(xì)胞分別接種于帶小塊蓋玻片的12孔培養(yǎng)板孔中，每孔約1 ml，細(xì)胞濃度分別為3.2×104個(gè)/ml，待其呈單層生長(zhǎng)后，吸棄培養(yǎng)液，以無菌的PBS輕輕沖洗3次后，加入不含雙抗的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 h，加入100 μl以不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液懸浮的 H37Rv株(細(xì)菌濃度為2.6×106CFU/ml)，然后加入不含雙抗的DMEM培養(yǎng)液1 ml，輕輕混勻，在37℃、5%CO2孵箱中分別孵育0、2、4、6、8、10、12 h 時(shí)，吸出孔內(nèi)液體，用自制微型蓋玻片夾夾出小蓋玻片，PBS輕輕沖洗3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，去固定液，用PBS輕輕沖洗3次，瀝干水份，切勿干燥。將其置于干凈的載玻片上，每張蓋玻片上加30 μl Palloidin-TRITC熒光染料(用1%BSA/PBS按1∶150稀釋)。室溫濕盒中靜置40 min后，用PBS輕輕沖洗5次，自然干燥，丙三醇/PBS封片，用無熒光軟布擦凈其背面，放在潔凈無熒光載玻片上，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞微絲重排情況及計(jì)算F-actin細(xì)胞骨架重排百分率，同時(shí)設(shè)不受侵入的DC2.4細(xì)胞為對(duì)照。F-actin重排百分率計(jì)算方法:熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，顯示典型點(diǎn)狀F-actin聚集者計(jì)1分，點(diǎn)狀聚集不明顯者計(jì)0.5分，F(xiàn)-actin不聚集者計(jì)0分［7］。F-actin重排百分率(%)= 總計(jì)分/200×100%。

1.5 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞微管變化 按上述方法將DC2.4細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，經(jīng)混合培養(yǎng)、固定后，每個(gè)玻片用5%BSA液對(duì)鼠源本底封閉30 min，再以1∶150稀釋鼠抗β-微管蛋白單克隆抗體作用30 min，PBS沖洗3次，然后用1∶100稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 40 μl于暗濕盒作用40 min，PBS沖洗3次，自然干燥，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞微管變化情況。

1.6 PLC分子測(cè)定 按上述不同感染時(shí)間段感染DC2.4細(xì)胞，同時(shí)以等量10%胎牛血清的DMEM為空白對(duì)照，重復(fù)4孔。收集細(xì)胞后分別以無菌PBS洗2次(1500 r/min離心10 min)，沉淀加入100 μl無菌 PBS后，冰上超聲破碎(400 V，10 s × 100)，12000 r/min 4℃ 離心30 min，分別收集含細(xì)胞漿蛋白上清和含細(xì)胞膜蛋白沉淀。采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，檢測(cè)DC2.4細(xì)胞漿液和細(xì)胞膜液中的PLC分子表達(dá)量。嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行操作，BIO-RAD Model 680全自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附儀450 nm測(cè)定A值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線YPLC=84.5X+8.1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算各組PLC分子的表達(dá)(ng/ml)。

1.7 PLC信號(hào)通路阻斷試驗(yàn) 在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行DC2.4細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層狀生長(zhǎng)后，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入2 ml DMEM培養(yǎng)液稀釋的PLC信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑U73122(終濃度為 10 μmol/L)，于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)處理DC2.4細(xì)胞30 min，然后再加入 H37Rv株混勻，采用上述(1.3、1.4和1.5節(jié))相同方法侵入DC2.4細(xì)胞，分別檢測(cè)PLC信號(hào)分子抑制劑U73122阻斷前后，細(xì)菌侵入率、DC2.4細(xì)胞的細(xì)胞微絲和細(xì)胞微管重排情況，以及DC2.4細(xì)胞細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中PLC分子表達(dá)的變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。各樣本均數(shù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，再行單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H37Rv株與 DC2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)H37Rv株與DC2.4細(xì)胞共育2 h，即見有細(xì)菌侵入，共育4、6、8、10、12 h 后，DC2.4 細(xì)胞的侵入率分別為(26.1±4.5)%、(39.9±5.6)%、(51.2±5.9)%、(57.9±6.1)%和(63.9±6.8)%，混合培養(yǎng)6 h以上，與混合培養(yǎng)2 h相比較，侵入率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);采用U73122預(yù)處理DC2.4細(xì)胞30 min后，再混合培養(yǎng) 4、6、8、10、12 h 后，DC2.4 細(xì)胞的侵入率則分別為(13.6±3.1)%、(14.2±3.9)%、(15.1±4.3)%、(16.8±4.0)%和(18.3±5.2)%;相同混合培養(yǎng)點(diǎn)，U73122末處理組的侵入率明顯高于U73122預(yù)處理組(P＜0.05，圖1)。侵入的細(xì)胞中可見H37Rv株呈單個(gè)分散排列，主要粘附或集聚在細(xì)胞表面，細(xì)胞內(nèi)可見較多中毒顆粒，隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，此現(xiàn)象愈加明顯，脫壁細(xì)胞增多;而經(jīng) U73122預(yù)處理后，H37Rv株較少集聚在細(xì)胞表面，內(nèi)吞細(xì)菌數(shù)顯著減少，也末見有脫壁細(xì)胞(圖2)。從而提示:PLC抑制劑U73122可阻止H37Rv株對(duì)DC2.4細(xì)胞的侵入。

圖1 人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株對(duì)DC2.4細(xì)胞的侵入率(n=4)Fig.1 Invasion rates of DC2.4 cells induced by H37Rv(n=4)

圖2 人結(jié)核分枝桿菌H37Rv與DC2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Effects of H37Rv strain co-cultured with DC2.4 cells

2.2 PLC信號(hào)通路阻斷前后，細(xì)胞微絲和F-actin重排率變化 熒光顯微鏡顯示，PLC信號(hào)通路阻斷前，H37Rv株感染0 h時(shí)，DC2.4細(xì)胞微絲排列緊密圓滑，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯;2 h時(shí)，細(xì)胞微絲開始出現(xiàn)解聚，呈點(diǎn)狀分布，點(diǎn)狀分布的微絲有聚集現(xiàn)象;4 h時(shí)，細(xì)胞微絲進(jìn)一步聚集，形成大小不等的環(huán);6～8 h時(shí)，多數(shù)微絲在細(xì)胞膜下邊聚明顯，形成皮質(zhì)應(yīng)力纖維;10 h后，細(xì)胞微絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)又有所恢復(fù)。而當(dāng)PLC信號(hào)通路阻斷后，在各感染時(shí)間段，均出現(xiàn)細(xì)胞F-actin的重排抑制現(xiàn)象(圖3)。H37Rv株與DC2.4 細(xì)胞混合培養(yǎng) 2、4、6、8、10、12 h 時(shí)，F(xiàn)-actin重排率分別為(26.9±1.5)%、(59.3±2.8)%、(72.7±4.8)%、(78.2±5.9)%、(63.3±2.9)%和(43.2±2.6)%，而PLC信號(hào)通路阻斷后，相同混合培養(yǎng)時(shí)間的F-actin重排率則分別為(18.5±1.2)%、(22.3±1.7)%、(23.6±2.5)%、(24.8±2.3)%、(22.3±1.3)%和(23.8±1.8)%;感染混合培養(yǎng)4、6、8、10 h時(shí)，PLC信號(hào)通路阻斷前的F-actin重排百分率明顯高于PLC信號(hào)通路阻斷后(P＜0.05，圖 4)。

2.3 PLC信號(hào)通路阻斷前后細(xì)胞微管變化H37Rv株入侵前，DC2.4細(xì)胞微管的網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)清晰可見，脈絡(luò)整齊，微管均勻地分布于胞體和突起內(nèi)。PLC信號(hào)通路阻斷前、后，H37Rv株與 DC2.4 細(xì)胞混合培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h時(shí)，均顯示細(xì)胞微管末出現(xiàn)發(fā)生扭曲、斷裂、紋理紊亂現(xiàn)象，也無網(wǎng)絡(luò)狀纖維結(jié)構(gòu)解聚出現(xiàn)。從而提示H37Rv株侵入DC2.4細(xì)胞時(shí)，并不發(fā)生細(xì)胞微管的重排(圖5)。

2.4 PLC信號(hào)通路阻斷前后，DC2.4細(xì)胞細(xì)胞漿液和細(xì)胞膜液中的PLC的分子表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，PLC信號(hào)通路阻斷前，H37Rv株與DC2.4細(xì)胞混合培養(yǎng)2 h時(shí)，細(xì)胞膜的PLC分子表達(dá)開始升高，至混合培養(yǎng)8 h時(shí)達(dá)最高(P＜0.05);當(dāng)PLC信號(hào)通路阻斷后，細(xì)胞膜的PLC分子的表達(dá)與正常對(duì)照相比較，無顯著性差異存在(P＞0.05);PLC信號(hào)通路阻斷前細(xì)胞膜的PLC分子表達(dá)明顯高于PLC信號(hào)通路阻斷后(P＜0.05)，而細(xì)胞漿中PLC分子表達(dá)在阻斷前、后變化不大。采用單因素方差分析結(jié)果也顯示，PLC信號(hào)通路阻斷前，細(xì)胞膜PLC分子表達(dá)在組內(nèi)存在顯著性差異(F值471.39，P ＜0.01)，共育 4、6、8、10、12 h 的 PLC分子表達(dá)在各組內(nèi)也存在顯著性差異(P＜0.01)。從而提示:PLC信號(hào)通路阻斷前PLC分子主要存在于DC2.4細(xì)胞細(xì)胞膜中，通過PLC信號(hào)分子抑制劑U73122阻斷了PLC信號(hào)通路，則主要是通過抑制了DC2.4細(xì)胞細(xì)胞膜中PLC分子表達(dá)來完成的，而對(duì)細(xì)胞漿中PLC分子表達(dá)影響不大(表1)。

3 討論

圖3 DC2.4細(xì)胞微絲的變化Fig.3 The microfilament aggregation in the DC2.4 cells

圖4 PLC抑制劑U73122對(duì)H37Rv株引起DC2.4細(xì)胞F-actin重排的影響(n=4)Fig.4 The influence of PLC inhibitor U73122 on the rearrangements of F-actin in DC 2.4 cells infected with H37Rv strain(n=4)

隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的不斷增加以及HIV與MTB的雙重感染，促使人們對(duì)結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。病原菌侵襲宿主細(xì)胞是傳染建立的重要環(huán)節(jié)，病原菌常借助宿主細(xì)胞骨架的高度可塑性及運(yùn)動(dòng)功能而侵襲細(xì)胞［8］。細(xì)胞骨架包括微絲(MF)、微管(MT)、中間纖維，并具有保持細(xì)胞外形、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等重要功能。MT貫穿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，一端與細(xì)胞膜相連，另一端與細(xì)胞核相連。細(xì)胞骨架具有錨定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如細(xì)胞核、線粒體等作用。研究證實(shí)MT與線粒體外膜聯(lián)系，游離核糖體附著于MT與MF的交叉點(diǎn)上，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［9］。宿主細(xì)胞受到病原菌刺激時(shí)，通過細(xì)胞骨架重排，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增高，線粒體膨脹，從而影響能量代謝及細(xì)胞色素C釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，病原菌黏附宿主細(xì)胞后，主要激活胞內(nèi)PLC信號(hào)通路，引起胞內(nèi)Ca2+濃度增加，觸發(fā)微絲肌動(dòng)蛋白(F-actin)細(xì)胞骨架重排，結(jié)果導(dǎo)致黏附的病原菌以內(nèi)吞方式入侵宿主細(xì)胞。DC是機(jī)體內(nèi)最有力的專職抗原呈遞細(xì)胞，既能啟動(dòng)初始免疫應(yīng)答，也能負(fù)向調(diào)控免疫反應(yīng)，在抗MTB感染中起著核心作用。然而對(duì)人結(jié)核分枝桿菌在侵入 DC時(shí)，能否通過激活胞內(nèi)PLC分子，觸發(fā)DC細(xì)胞骨架重排而侵入DC的機(jī)制尚不清楚。

圖5 DC2.4細(xì)胞微管的變化Fig.5 The microtubule aggregation in the DC2.4 cells

表1 PLC分子的表達(dá)Table 1 Expression of PLC molecules(n=4，，ng·ml－1)

表1 PLC分子的表達(dá)Table 1 Expression of PLC molecules(n=4，，ng·ml－1)

a:與正常細(xì)胞膜對(duì)照組比較，P＜0.05;b:與PLC分子阻斷后細(xì)胞膜組比較，P＜0.05;c:與正常細(xì)胞膜對(duì)照組比較，P＞0.05.

組 別共育時(shí)間/h 02 46 810 12 F值 P值PLC 阻斷前細(xì)胞漿 26.5 ±1.727 .5 ±1.8 28.9 ±1.7 31.7 ±2.5 34.3 ±3.9 33.9 ±3.4 33.6 ±3.5 4.65 ＞0.05細(xì)胞膜 30.9 ±2.340 .0 ±3.4a48.7 ±3.8ab93.0 ±9.0ab225.8 ±10.4ab166.4 ±8.8ab105.6 ±6.4ab471.39 ＜0.01 PLC阻斷后細(xì)胞漿 26.5 ±1.728 .5 ±1.8 27.9 ±2.2 31.8 ±2.5 33.7 ±3.1 34.8 ±3.5 34.1 ±3.7 3.63 ＞0.05細(xì)胞膜 29.1 ±2.130 .4 ±1.9 35.9 ±2.2c 36.3 ±2.4c 34.1 ±4.6c 37.2 ±3.8c 36.4 ±2.4c 5.49 ＞0.05正常對(duì)照組細(xì)胞漿 28.3 ±1.430 .7 ±2.6 29.6 ±1.8 30.7 ±2.4 32.6 ±2.9 31.3 ±3.2 33.6 ±3.8 4.19 ＞0.05細(xì)胞膜 29.5 ±1.830 .2 ±1.9 31.8 ±2.6 33.0 ±2.2 34.7 ±2.7 35.1 ±3.2 36.2 ±3.4 4.94 ＞0.05 F 值 4.66 4.88 73.69 142.20 426.35 385.77 276.81 83.68 P 值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

本研究發(fā)現(xiàn)，人結(jié)核分枝桿菌H37Rv株與DC2.4細(xì)胞共育2 h，便見有細(xì)菌侵入，并呈單個(gè)分散排列狀粘附或集聚在細(xì)胞表面;H37Rv株與 DC2.4 細(xì)胞共育 4、6、8、10、12 h 后，DC2.4細(xì)胞的侵入率分別為(26.1±4.5)%、(39.9±5.6)%、(51.2±5.9)%、(57.9±6.1)%和(63.9±6.8)%，其中侵入6 h與2 h相比較存在著顯著性差異(P＜0.05);采用U73122預(yù)處理DC2.4細(xì)胞30 min后，DC2.4細(xì)胞的侵入率則分別為(13.6±3.1)%、(14.2±3.9)%、(15.1±4.3)%、(16.8±4.0)%和(18.3±5.2)%，U73122末處理組的侵入率明顯高于U73122預(yù)處理組(P＜0.05)。此外，在PLC信號(hào)通路阻斷前H37Rv株入侵DC2.4細(xì)胞2、4、6、8、10、12 h 時(shí)，F(xiàn)-actin 重排率分別為(26.9±1.5)%、(59.3±2.8)%、(72.7±4.8)%、(78.2±5.9)%、(63.3±2.9)% 和(43.2±2.6)%，而PLC信號(hào)通路阻斷后，相同感染時(shí)間的F-actin重排率則分別為(18.5±1.2)%、(22.3±1.7)%、(23.6±2.5)%、(24.8±2.3)%、(22.3±1.3)%和(23.8±1.8)%。PLC分子阻斷前的F-actin重排率明顯高于PLC分子阻斷后(P＜0.05)，熒光顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)，H37Rv株與DC2.4細(xì)胞共育過程中，DC細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)MF明顯增加，胞膜邊緣點(diǎn)狀熒光顆粒(MF)增強(qiáng)，并逐漸由點(diǎn)狀向線狀重排，6～8 h時(shí)MF在胞膜內(nèi)側(cè)重排完整;但在相同混合培養(yǎng)時(shí)間段，PLC分子阻斷前、后，DC2.4細(xì)胞微管則末出現(xiàn)重排現(xiàn)象。從而提示:PLC分子抑制劑U73122可明顯降低H37Rv株對(duì)DC2.4細(xì)胞的侵入率以及DC微絲F-actin重排率，MTB侵入DC主要通過觸發(fā)DC微絲F-actin細(xì)胞骨架重排來完成，而與細(xì)胞微管的重排無關(guān)。由此，我們推測(cè)結(jié)核分枝桿菌可通過激活PLC分子，觸發(fā)DC F-actin細(xì)胞骨架重排而侵入至胞內(nèi)。

眾所周知，PLC能水解膜磷脂中的磷脂酰肌醇-4，5二磷酸(PIP2)，產(chǎn)生三磷酸肌醇(inositol-1，4，5-trisphophate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DAG);IP3主要引起胞內(nèi)的游離Ca2+增加，從而激活多種Ca2+依賴的反應(yīng)，如微絲肌動(dòng)蛋白(F-actin)細(xì)胞骨架重排，而DAG則激活蛋白激酶C(PKC)。研究證實(shí)，單核細(xì)胞增多性李斯特菌在黏附侵入小鼠單核樣巨噬細(xì)胞J774A.1時(shí)，可引起細(xì)胞膜表面的PLC分子表達(dá)量增高［10］。因此，MTB感染DC時(shí)，能否引起細(xì)胞膜上的PLC分子表達(dá)量的增高值得研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTB感染后，PLC分子表達(dá)量的增加主要存在于DC2.4細(xì)胞細(xì)胞膜上，且于H37Rv株侵入2 h后，細(xì)胞膜中的PLC分子表達(dá)量即開始升高，至侵入8 h時(shí)達(dá)最高。U73122阻斷PLC分子表達(dá)主要是通過抑制了DC2.4細(xì)胞膜中PLC分子來完成的，而對(duì)細(xì)胞漿液中的PLC分子影響不大。

綜上所述，人結(jié)核分枝桿菌可通過激活PLC信號(hào)分子，觸發(fā)F-actin細(xì)胞骨架重排，進(jìn)而侵入DC、PLC分子表達(dá)量的升高而主要存在于DC細(xì)胞膜上。一方面，本研究初步闡明了人結(jié)核分枝桿菌侵入DC的機(jī)制，另一方面，該研究也為今后在臨床治療中，能否研制出一種藥物或疫苗能有效阻止此過程發(fā)生而提供了新思路。

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