陳 強，朱歡歡，張媛媛，張 媛，王利宏，鄭良榮

(1.浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內科，浙江 杭州 310003;2.浙江大學醫(yī)學院附屬義烏醫(yī)院心內科，浙江 義烏 322000)

辣椒素(capsaicin，CAP)是辣椒的活性成分，常常作為一種食品添加劑為人們食用，是瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)的高選擇性激動劑。1997年，Caterina等成功克隆辣椒素受體，命名為香草酸受體亞型1(vanilloid receptor type1，VR1)，因與瞬時受體電位(TRP)家族的一些成員在氨基酸序列上有23%的同源性，又命名為TRPV1，是一種配體門控的非選擇性陽離子通道。TRPV1分布廣泛，在心血管系統(tǒng)和腎臟組織中的初級感覺神經元中表達豐富。CAP可激活TRPV1，引起感覺神經末梢CGRP、SP 等血管活性遞質的釋放。

研究表明，CAP具有鎮(zhèn)痛止癢、抗炎消腫、調節(jié)食欲和治療消化道疾病、預防心血管疾病、防治風濕、抗癌和減肥等作用，長期CAP飲食還可降低和預防高血壓。目前為止，CAP急性激活TRPV1后血管舒張作用機制的研究多集中在大容量血管上，如主動脈，腸系膜動脈等，其對大鼠腸系膜阻力血管的舒張作用及機制未見報道。鑒于外周阻力血管在血壓調節(jié)中重要作用，本研究使用離體大鼠腸系膜阻力血管來探討CAP舒張效應及其內在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及動物 生理鹽溶液(physiological salt solution，PSS)成分(mmol/L):NaCl 119，KCl 4.7、KHPO1.2、MgSO1.2、NaHCO25、glucose 11.1、CaCl1.6，pH 7.4。辣椒素(capsaicin，CAP)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、L-N-硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P 物質 (substance P，SP)、CGRP8-37均購自Sigma公司，其余試劑為市售分析純。CAP溶于乙醇溶液中，乙醇終濃度不超過0.1%，預實驗表明，本實驗中所用的乙醇濃度對腸系膜血管張力測定無影響。

雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250～350 g，購自浙江大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 實驗方法 SD大鼠經水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后斷頭處死。在連續(xù)變倍體視顯微鏡下，將腸系膜上動脈三級血管迅速取出，移至預冷4℃通以95%O+5%CO的PSS液中。清除血管周圍脂肪和結締組織，避免損傷血管內皮，剪取長約2.0～2.5 mm左右血管環(huán)。根據實驗需要，用大鼠觸須摩擦血管環(huán)內表面去內皮。將血管環(huán)置于含5 ml PSS液的浴槽中，保持溫度在37℃，pH 7.4，持續(xù)通以95%O+5%CO混合氣體，懸掛于兩段不銹鋼金屬絲中(直徑0.039 mm)。其中，一段金屬絲連于張力傳感器上，另一段金屬絲固定于肌動描記記錄儀(DMT 610M，Denmark)的升降臂上。血管在浴槽中零張力靜置30 min，而后調至靜息張力，該張力相當于100 mmHg下血管直徑0.9倍的張力。血管環(huán)在該張力下孵育30 min，每隔15 min更換一次PSS液。用KCl(6×10mol/L)預收縮，待收縮幅度穩(wěn)定后洗脫，重復3次，以激發(fā)血管環(huán)的最大收縮活性。

觀察血管環(huán)內皮完整性:浴槽中加PE(5×10mol/L)，收縮達峰值穩(wěn)定后，加入 ACh(10mol/L)，觀察血管環(huán)的舒張反應。若加Ach后使PE預收縮的血管舒張大于90%，可認為內皮完整;反之，內皮不完整，棄去。

觀察血管環(huán)去內皮效果:觸須摩擦去除血管內皮細胞后，浴槽中加PE(5×10mol/L)，收縮達峰值穩(wěn)定后，加入ACh(10mol/L)，觀察血管環(huán)的舒張反應。若加ACh后使PE預收縮的血管舒張小于5%，可認為去內皮成功;反之，去內皮不成功，棄去。

1.3 實驗分組

1.3.1 測定CAP對PE預收縮腸系膜動脈環(huán)張力的作用 取內皮完整或去內皮的大鼠腸系膜動脈環(huán)，預檢測穩(wěn)定后，加入PE(10mol/L)，待血管環(huán)預收縮達到穩(wěn)定后:采用累積加藥方法，逐步增加 CAP 的濃度(10，3 ×10，10，3 × 10，10，3 × 10，10，3 × 10，10mol/L)，以加入CAP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來反映血管張力的變化，繪制CAP濃度-舒張曲線圖;對照組累積加入不含CAP的PSS液，以血管張力自然下降幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來反映血管張力的變化。

CAP誘導的最大舒張反應(E)為CAP誘導的血管張力下降幅度占PE(10mol/L)誘發(fā)最大收縮幅度的最大百分比;應用Graphpad Prism 5.0軟件計算半數有效濃度(EC)，以 P表示 －log［EC］。

1.3.2 測定 L-NAME 及 CGRP8-37對 CAP誘導的舒張反應的作用 內皮完整的血管環(huán)穩(wěn)定后，用 L-NAME(3×10mol/L)及 CGRP競爭性受體阻滯劑CGRP8-37(2×10mol/L)預孵育30 min后，加入 PE(10mol/L)，待血管環(huán)收縮穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，逐步增加CAP 的濃度(10～10mol/L)。以加入 CAP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來反映血管張力的變化，繪制CAP濃度-舒張曲線圖。

1.3.3 測定外源性CGRP對PE預收縮腸系膜動脈環(huán)張力的作用 取內皮完整或去內皮的大鼠腸系膜動脈環(huán)穩(wěn)定后，加入PE(10mol/L)，待血管環(huán)預收縮達到穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，逐步增加外源性CGRP的濃度(10，3 × 10，10，3 × 10，10，3 × 10mol/L)。以加入外源性CGRP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來反映血管張力的變化，繪制CGRP濃度-舒張曲線圖。

1.3.4 測定SP對PE預收縮腸系膜動脈環(huán)張力的作用 取內皮完整及去內皮的大鼠腸系膜動脈環(huán)穩(wěn)定后，加入PE(10mol/L)，待血管環(huán)預收縮達到穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，逐步增加 SP 的濃度(10，10，10，10mol/L)。以加入SP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來反映血管張力的變化，繪制SP濃度-舒張曲線圖。

2 結果

2.1 CAP對PE預收縮腸系膜動脈阻力血管的作用 圖1示，與各自空白對照組(Con+E)、(Con-E)相比，CAP(10～10mol/L)對PE預收縮的內皮完整CAP實驗組(CAP+E)、去內皮CAP實驗組(CAP-E)的血管產生濃度依賴性舒張作用，其中內皮完整組的血管舒張作用比去內皮組更明顯，兩者相比CAP在10～10mol/L時，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖 1)。CAP+E組 E值高于 CAP-E組，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1);同時，CAP+E組P值低于CAP-E組，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1)。表明CAP對PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用具有部分內皮依賴性。

圖1 內皮對CAP舒血管效應的影響Fig.1 Effect of endothelium on capsaicin-induced relaxation in rat mesenteric arteries

表1 CAP對腸系膜動脈的最大舒張反應(Emax)及半數有效濃度(PEC50)Table 1 Emaxand PEC50for CAP in mesenteric arteries from rat

2.2 L-NAME及CGRP8-37對CAP誘導的舒張反應的作用 在內皮完整的腸系膜動脈環(huán)中，用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)阻斷劑L-NAME及CGRP競爭性阻滯劑CGRP8-37預處理30 min。

2.2.1 L-NAME預處理組 在CAP濃度為10mol/L～10mol/L 灌流液中，NOS阻斷劑L-NAME預處理組的血管張力大于CAP對照組(P＜0.05，圖2A);L-NAME預處理可以顯著減弱CAP濃度依賴性的舒血管作用，其E值為(86.77±4.92)%，而 CAP+E組 E值為(97.26±1.62)%，兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表1);其P值高于對照組(P＜0.01，表1)。表明 L-NAME部分阻斷了 CAP對PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用。

2.2.2 CGRP8-37預處理組 在CAP濃度為3×10～10mol/L灌流液中，CGRP8-37預處理組的血管張力大于CAP對照組(P＜0.01，圖2A)和 L-NAME組(P＜0.01，圖2C);CGRP8-37可以顯著削弱CAP濃度依賴性的舒血管作用，阻斷血管舒張作用較L-NAME強，其E值低于CAP+E和L-NAME組E。前者與后兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表1);其P值高于對照組(P＜0.01，表 1)。表明CGRP8-37部分阻斷了CAP對PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用，且阻斷作用較L-NAME強。

2.2.3 L-NAME+CGRP8-37預處理組 在CAP濃度為3×10mol/L～10mol/L灌流液中，L-NAME+CGRP8-37預處理組的血管張力大于CAP對照組、L-NAME組和CGRP8-37組(P ＜0.01，圖2B、2C);L-NAME+CGRP8-37 阻斷了CAP濃度依賴性的舒血管作用，兩種阻斷劑具有疊加效應，其 E值低于 CAP+E、L-NAME和CGRP8-37組，與后三者相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表1);在 CAP各濃度下，L-NAME+CGRP8-37組血管張力與空白Con+E組相比，兩者相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，圖 2B)。其 P值低于 CAP對照組、L-NAME組、CGRP8-37組(P ＜0.01，表1)。表明L-NAME+CGRP8-37基本阻斷了CAP對PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用。

2.3 外源性CGRP對PE預收縮腸系膜動脈環(huán)張力的作用 圖3示，與相應空白對照組相比，外源性 CGRP(10～3×10mol/L)對 PE 預收縮的內皮完整CGRP組(CGRP+E)、去內皮CGRP組(CGRP-E)的血管環(huán)均產生濃度依賴性的舒張作用。在CGRP濃度為3×10～3×10mol/L灌流液中，去內皮組血管張力顯著大于內皮完整組(P＜0.05，圖3)。CGRP+E組血管環(huán)的最大舒張反應E值為(100.26±1.26)%，血管舒張反應的半數有效濃度P值 8.78±0.03，均顯著高于 CGRP-E組E:(91.13±5.79)%和P:8.57±0.04(P＜0.01，表2)。表明CGRP對PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用具有部分內皮依賴性。

圖2 L-NAME、CGRP8-37、L-NAME+CGRP8-37預處理對CAP舒血管效應的影響Fig.2 Effect of pretreatment with L-NAME，CGRP8-37 and L-NAME+CGRP8-37 on capsaicin-induced relaxation in rat mesenteric arteries

圖3 內皮對CGRP舒血管效應的影響Fig.3 Effect of endothelium on CGRP-induced relaxation in rat mesenteric arteries

表2 CGRP對腸系膜動脈的最大舒張反應(Emax)及半數有效濃度(PEC50)Table 2 Emaxand PEC50for CGRP in mesenteric arteries from rat

2.4 SP對PE預收縮腸系膜動脈環(huán)張力的作用 如圖4所示，在內皮完整的腸系膜動脈環(huán)中，SP(10～10mol/L)對 PE 預收縮的腸系膜動脈環(huán)無明顯濃度依賴性舒張作用。

3 討論

圖4 SP舒血管效應的代表性張力記錄圖形Fig.4 Representative tracings showing SP-induced relaxation in rat mesenteric arteries

本實驗首次表明，CAP可濃度依賴性舒張PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管，其機制涉及以下兩方面:部分內皮依賴性的血管舒張作用，和NO合成及釋放有關，可被NOS抑制劑LNAME阻斷;另一方面和CGRP釋放有關，可被CGRP競爭性阻滯劑CGRP8-37阻斷。

之前研究表明，在內皮完整血管中，血管內皮細胞中的eNOS可催化L-精氨酸生成 NO，NO作為信號分子進入血管平滑肌細胞，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)，增加環(huán)鳥苷酸cGMP含量;從而激活cGMP依賴性蛋白激酶使鈣內流減少，增加肌漿網上鈣ATP酶對鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張。本實驗中去除內皮細胞或NOS抑制劑L-NAME預處理后顯著削弱CAP的血管舒張作用，提示CAP的血管舒張作用可能通過NO途徑介導。

CGRP是迄今發(fā)現的最強的內源性舒張血管物質，其擴血管作用比前列腺素(PG)、ACh、三磷酸腺苷(ATP)、5-羥色胺(5-HT)、SP、血管活性肽(VIP)以及異丙腎上腺素強，且對全身血管有不同程度的擴張作用，是一種廣譜擴血管物質。本實驗發(fā)現，用CGRP競爭性阻滯劑CGRP8-37可顯著抑制CAP介導的舒血管效應，提示CGRP在CAP舒血管效應中具有重要作用;合用L-NAME+CGRP8-37后基本阻斷了血管舒張，表明CAP舒血管效應主要通過產生NO、CGRP兩條路徑發(fā)揮作用;同時CGRP8-37的阻斷作用強于L-NAME，進一步表明CGRP在這兩條路徑中起到了主要作用。之前Brztz等研究發(fā)現，CAP呈劑量依賴性方式舒張豬冠狀動脈，其舒張作用可被辣椒平(capsazepine，CPZ)、去內皮、NOS 和鉀通道阻斷劑阻斷;Yang等發(fā)現CAP舒張小鼠腸系膜阻力血管作用可被 L-NAME、CGRP8-37阻斷。同時也存在爭議，Gupta等發(fā)現CAP舒張人和豬的冠狀動脈不是通過 CGRP、NK1、NO、TRPV1 受體、電壓敏感性鈣通道、鉀通道或cAMP介導的機制，而是可能通過非特異性、非CGRP依賴性機制。此外，本實驗還進一步研究了外源性CGRP舒血管效應，證實了CGRP對內皮完整和去內皮的血管均有濃度依賴性舒張作用，同時內皮完整組優(yōu)于去內皮組。提示內皮途徑部分參與了舒血管作用，CGRP對大鼠腸系膜阻力血管的舒張方式是部分內皮依賴性。這與之前Brain等研究表明，CGRP對兔的主動脈和腸系膜阻力動脈、大鼠主動脈、大鼠肺動脈、人內乳動脈內皮依賴性舒張方式不同，這可能和種屬、部位器官、血管粗細差異有關。CGRP舒張血管方式分為內皮依賴性和非內皮依賴性，具體機制目前還不十分清楚，有待進一步的研究。

CAP可激活TRPV1受體，引起感覺神經末梢CGRP、SP等血管活性遞質的釋放。之前研究表明，SP是一種重要的神經傳導介質，能夠把疼痛瘙癢刺激由外周神經傳入脊髓神經和高級中樞神經;在人冠狀動脈中，SP可內皮依賴性舒張血管;SP的舒張機制可能與激活大動脈壁上NK1-R受體有關。但本實驗中，SP對PE預收縮的大鼠腸系膜阻力血管未見明顯的舒張反應，表明了CAP舒血管效應是通過非SP途徑實現。

綜上所述，本實驗結果表明，CAP對大鼠腸系膜動脈阻力血管具有濃度依賴性舒張作用，其具體機制包括兩方面:部分內皮依賴性舒張血管，與其促進內皮細胞NOS-NO通路有關;另一方面，非內皮依賴性舒張血管和CGRP釋放有關。

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