陳 強(qiáng)，朱歡歡，張媛媛，張 媛，王利宏，鄭良榮

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 杭州 310003;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬義烏醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 義烏 322000)

辣椒素(capsaicin，CAP)是辣椒的活性成分，常常作為一種食品添加劑為人們食用，是瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)的高選擇性激動(dòng)劑。1997年，Caterina等成功克隆辣椒素受體，命名為香草酸受體亞型1(vanilloid receptor type1，VR1)，因與瞬時(shí)受體電位(TRP)家族的一些成員在氨基酸序列上有23%的同源性，又命名為TRPV1，是一種配體門控的非選擇性陽(yáng)離子通道［1］。TRPV1分布廣泛，在心血管系統(tǒng)和腎臟組織中的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)豐富［2］。CAP可激活TRPV1，引起感覺(jué)神經(jīng)末梢CGRP、SP 等血管活性遞質(zhì)的釋放［3-4］。

研究表明，CAP具有鎮(zhèn)痛止癢、抗炎消腫、調(diào)節(jié)食欲和治療消化道疾病、預(yù)防心血管疾病、防治風(fēng)濕、抗癌和減肥等作用，長(zhǎng)期CAP飲食還可降低和預(yù)防高血壓［5-7］。目前為止，CAP急性激活TRPV1后血管舒張作用機(jī)制的研究多集中在大容量血管上，如主動(dòng)脈，腸系膜動(dòng)脈等，其對(duì)大鼠腸系膜阻力血管的舒張作用及機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。鑒于外周阻力血管在血壓調(diào)節(jié)中重要作用，本研究使用離體大鼠腸系膜阻力血管來(lái)探討CAP舒張效應(yīng)及其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及動(dòng)物 生理鹽溶液(physiological salt solution，PSS)成分(mmol/L):NaCl 119，KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325、glucose 11.1、CaCl21.6，pH 7.4。辣椒素(capsaicin，CAP)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、L-N-硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P 物質(zhì) (substance P，SP)、CGRP8-37均購(gòu)自Sigma公司，其余試劑為市售分析純。CAP溶于乙醇溶液中，乙醇終濃度不超過(guò)0.1%，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)中所用的乙醇濃度對(duì)腸系膜血管張力測(cè)定無(wú)影響。

雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250～350 g，購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 SD大鼠經(jīng)水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后斷頭處死。在連續(xù)變倍體視顯微鏡下，將腸系膜上動(dòng)脈三級(jí)血管迅速取出，移至預(yù)冷4℃通以95%O2+5%CO2的PSS液中。清除血管周圍脂肪和結(jié)締組織，避免損傷血管內(nèi)皮，剪取長(zhǎng)約2.0～2.5 mm左右血管環(huán)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，用大鼠觸須摩擦血管環(huán)內(nèi)表面去內(nèi)皮。將血管環(huán)置于含5 ml PSS液的浴槽中，保持溫度在37℃，pH 7.4，持續(xù)通以95%O2+5%CO2混合氣體，懸掛于兩段不銹鋼金屬絲中(直徑0.039 mm)。其中，一段金屬絲連于張力傳感器上，另一段金屬絲固定于肌動(dòng)描記記錄儀(DMT 610M，Denmark)的升降臂上。血管在浴槽中零張力靜置30 min，而后調(diào)至靜息張力，該張力相當(dāng)于100 mmHg下血管直徑0.9倍的張力。血管環(huán)在該張力下孵育30 min，每隔15 min更換一次PSS液。用KCl(6×10－2mol/L)預(yù)收縮，待收縮幅度穩(wěn)定后洗脫，重復(fù)3次，以激發(fā)血管環(huán)的最大收縮活性。

觀察血管環(huán)內(nèi)皮完整性:浴槽中加PE(5×10－6mol/L)，收縮達(dá)峰值穩(wěn)定后，加入 ACh(10－6mol/L)，觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)。若加Ach后使PE預(yù)收縮的血管舒張大于90%，可認(rèn)為內(nèi)皮完整;反之，內(nèi)皮不完整，棄去。

觀察血管環(huán)去內(nèi)皮效果:觸須摩擦去除血管內(nèi)皮細(xì)胞后，浴槽中加PE(5×10－6mol/L)，收縮達(dá)峰值穩(wěn)定后，加入ACh(10－6mol/L)，觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)。若加ACh后使PE預(yù)收縮的血管舒張小于5%，可認(rèn)為去內(nèi)皮成功;反之，去內(nèi)皮不成功，棄去。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1 測(cè)定CAP對(duì)PE預(yù)收縮腸系膜動(dòng)脈環(huán)張力的作用 取內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)，預(yù)檢測(cè)穩(wěn)定后，加入PE(10－5mol/L)，待血管環(huán)預(yù)收縮達(dá)到穩(wěn)定后:采用累積加藥方法，逐步增加 CAP 的濃度(10－9，3 ×10－9，10－8，3 × 10－8，10－7，3 × 10－7，10－6，3 × 10－6，10－5mol/L)，以加入CAP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來(lái)反映血管張力的變化，繪制CAP濃度-舒張曲線圖;對(duì)照組累積加入不含CAP的PSS液，以血管張力自然下降幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來(lái)反映血管張力的變化。

CAP誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)(Emax)為CAP誘導(dǎo)的血管張力下降幅度占PE(10－5mol/L)誘發(fā)最大收縮幅度的最大百分比;應(yīng)用Graphpad Prism 5.0軟件計(jì)算半數(shù)有效濃度(EC50)，以 PEC50表示 －log［EC50］。

1.3.2 測(cè)定 L-NAME 及 CGRP8-37對(duì) CAP誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)的作用 內(nèi)皮完整的血管環(huán)穩(wěn)定后，用 L-NAME(3×10－4mol/L)及 CGRP競(jìng)爭(zhēng)性受體阻滯劑CGRP8-37(2×10－6mol/L)預(yù)孵育30 min后，加入 PE(10－5mol/L)，待血管環(huán)收縮穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，逐步增加CAP 的濃度(10－9～10－5mol/L)。以加入 CAP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來(lái)反映血管張力的變化，繪制CAP濃度-舒張曲線圖。

1.3.3 測(cè)定外源性CGRP對(duì)PE預(yù)收縮腸系膜動(dòng)脈環(huán)張力的作用 取內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，加入PE(10－5mol/L)，待血管環(huán)預(yù)收縮達(dá)到穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，逐步增加外源性CGRP的濃度(10－10，3 × 10－10，10－9，3 × 10－9，10－8，3 × 10－8mol/L)。以加入外源性CGRP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來(lái)反映血管張力的變化，繪制CGRP濃度-舒張曲線圖。

1.3.4 測(cè)定SP對(duì)PE預(yù)收縮腸系膜動(dòng)脈環(huán)張力的作用 取內(nèi)皮完整及去內(nèi)皮的大鼠腸系膜動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后，加入PE(10－5mol/L)，待血管環(huán)預(yù)收縮達(dá)到穩(wěn)定后，采用累積加藥方法，逐步增加 SP 的濃度(10－9，10－8，10－7，10－6mol/L)。以加入SP后血管張力幅度與PE誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度之間的比值來(lái)反映血管張力的變化，繪制SP濃度-舒張曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 CAP對(duì)PE預(yù)收縮腸系膜動(dòng)脈阻力血管的作用 圖1示，與各自空白對(duì)照組(Con+E)、(Con-E)相比，CAP(10－8～10－5mol/L)對(duì)PE預(yù)收縮的內(nèi)皮完整CAP實(shí)驗(yàn)組(CAP+E)、去內(nèi)皮CAP實(shí)驗(yàn)組(CAP-E)的血管產(chǎn)生濃度依賴性舒張作用，其中內(nèi)皮完整組的血管舒張作用比去內(nèi)皮組更明顯，兩者相比CAP在10－7～10－5mol/L時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖 1)。CAP+E組 Emax值高于 CAP-E組，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1);同時(shí)，CAP+E組PEC50值低于CAP-E組，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。表明CAP對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用具有部分內(nèi)皮依賴性。

圖1 內(nèi)皮對(duì)CAP舒血管效應(yīng)的影響Fig.1 Effect of endothelium on capsaicin-induced relaxation in rat mesenteric arteries

表1 CAP對(duì)腸系膜動(dòng)脈的最大舒張反應(yīng)(Emax)及半數(shù)有效濃度(PEC50)Table 1 Emaxand PEC50for CAP in mesenteric arteries from rat

2.2 L-NAME及CGRP8-37對(duì)CAP誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)的作用 在內(nèi)皮完整的腸系膜動(dòng)脈環(huán)中，用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)阻斷劑L-NAME及CGRP競(jìng)爭(zhēng)性阻滯劑CGRP8-37預(yù)處理30 min。

2.2.1 L-NAME預(yù)處理組 在CAP濃度為10－7mol/L～10－5mol/L 灌流液中，NOS阻斷劑L-NAME預(yù)處理組的血管張力大于CAP對(duì)照組(P＜0.05，圖2A);L-NAME預(yù)處理可以顯著減弱CAP濃度依賴性的舒血管作用，其Emax值為(86.77±4.92)%，而 CAP+E組 Emax值為(97.26±1.62)%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1);其PEC50值高于對(duì)照組(P＜0.01，表1)。表明 L-NAME部分阻斷了 CAP對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用。

2.2.2 CGRP8-37預(yù)處理組 在CAP濃度為3×10－8～10－5mol/L灌流液中，CGRP8-37預(yù)處理組的血管張力大于CAP對(duì)照組(P＜0.01，圖2A)和 L-NAME組(P＜0.01，圖2C);CGRP8-37可以顯著削弱CAP濃度依賴性的舒血管作用，阻斷血管舒張作用較L-NAME強(qiáng)，其Emax值低于CAP+E和L-NAME組Emax。前者與后兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1);其PEC50值高于對(duì)照組(P＜0.01，表 1)。表明CGRP8-37部分阻斷了CAP對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用，且阻斷作用較L-NAME強(qiáng)。

2.2.3 L-NAME+CGRP8-37預(yù)處理組 在CAP濃度為3×10－8mol/L～10－5mol/L灌流液中，L-NAME+CGRP8-37預(yù)處理組的血管張力大于CAP對(duì)照組、L-NAME組和CGRP8-37組(P ＜0.01，圖2B、2C);L-NAME+CGRP8-37 阻斷了CAP濃度依賴性的舒血管作用，兩種阻斷劑具有疊加效應(yīng)，其 Emax值低于 CAP+E、L-NAME和CGRP8-37組，與后三者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表1);在 CAP各濃度下，L-NAME+CGRP8-37組血管張力與空白Con+E組相比，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，圖 2B)。其 PEC50值低于 CAP對(duì)照組、L-NAME組、CGRP8-37組(P ＜0.01，表1)。表明L-NAME+CGRP8-37基本阻斷了CAP對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用。

2.3 外源性CGRP對(duì)PE預(yù)收縮腸系膜動(dòng)脈環(huán)張力的作用 圖3示，與相應(yīng)空白對(duì)照組相比，外源性 CGRP(10－10～3×10－8mol/L)對(duì) PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整CGRP組(CGRP+E)、去內(nèi)皮CGRP組(CGRP-E)的血管環(huán)均產(chǎn)生濃度依賴性的舒張作用。在CGRP濃度為3×10－9～3×10－8mol/L灌流液中，去內(nèi)皮組血管張力顯著大于內(nèi)皮完整組(P＜0.05，圖3)。CGRP+E組血管環(huán)的最大舒張反應(yīng)Emax值為(100.26±1.26)%，血管舒張反應(yīng)的半數(shù)有效濃度PEC50值 8.78±0.03，均顯著高于 CGRP-E組Emax:(91.13±5.79)%和PEC50:8.57±0.04(P＜0.01，表2)。表明CGRP對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管舒張作用具有部分內(nèi)皮依賴性。

圖2 L-NAME、CGRP8-37、L-NAME+CGRP8-37預(yù)處理對(duì)CAP舒血管效應(yīng)的影響Fig.2 Effect of pretreatment with L-NAME，CGRP8-37 and L-NAME+CGRP8-37 on capsaicin-induced relaxation in rat mesenteric arteries

圖3 內(nèi)皮對(duì)CGRP舒血管效應(yīng)的影響Fig.3 Effect of endothelium on CGRP-induced relaxation in rat mesenteric arteries

表2 CGRP對(duì)腸系膜動(dòng)脈的最大舒張反應(yīng)(Emax)及半數(shù)有效濃度(PEC50)Table 2 Emaxand PEC50for CGRP in mesenteric arteries from rat

2.4 SP對(duì)PE預(yù)收縮腸系膜動(dòng)脈環(huán)張力的作用 如圖4所示，在內(nèi)皮完整的腸系膜動(dòng)脈環(huán)中，SP(10－9～10－6mol/L)對(duì) PE 預(yù)收縮的腸系膜動(dòng)脈環(huán)無(wú)明顯濃度依賴性舒張作用。

3 討論

圖4 SP舒血管效應(yīng)的代表性張力記錄圖形Fig.4 Representative tracings showing SP-induced relaxation in rat mesenteric arteries

本實(shí)驗(yàn)首次表明，CAP可濃度依賴性舒張PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管，其機(jī)制涉及以下兩方面:部分內(nèi)皮依賴性的血管舒張作用，和NO合成及釋放有關(guān)，可被NOS抑制劑LNAME阻斷;另一方面和CGRP釋放有關(guān)，可被CGRP競(jìng)爭(zhēng)性阻滯劑CGRP8-37阻斷。

之前研究表明，在內(nèi)皮完整血管中，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS可催化L-精氨酸生成 NO，NO作為信號(hào)分子進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞，激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(sGC)，增加環(huán)鳥(niǎo)苷酸cGMP含量［8］;從而激活cGMP依賴性蛋白激酶使鈣內(nèi)流減少，增加肌漿網(wǎng)上鈣ATP酶對(duì)鈣的攝取或直接作用于收縮蛋白去磷酸化而使血管舒張［9］。本實(shí)驗(yàn)中去除內(nèi)皮細(xì)胞或NOS抑制劑L-NAME預(yù)處理后顯著削弱CAP的血管舒張作用，提示CAP的血管舒張作用可能通過(guò)NO途徑介導(dǎo)。

CGRP是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性舒張血管物質(zhì)，其擴(kuò)血管作用比前列腺素(PG)、ACh、三磷酸腺苷(ATP)、5-羥色胺(5-HT)、SP、血管活性肽(VIP)以及異丙腎上腺素強(qiáng)，且對(duì)全身血管有不同程度的擴(kuò)張作用，是一種廣譜擴(kuò)血管物質(zhì)［10］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用CGRP競(jìng)爭(zhēng)性阻滯劑CGRP8-37可顯著抑制CAP介導(dǎo)的舒血管效應(yīng)，提示CGRP在CAP舒血管效應(yīng)中具有重要作用;合用L-NAME+CGRP8-37后基本阻斷了血管舒張，表明CAP舒血管效應(yīng)主要通過(guò)產(chǎn)生NO、CGRP兩條路徑發(fā)揮作用;同時(shí)CGRP8-37的阻斷作用強(qiáng)于L-NAME，進(jìn)一步表明CGRP在這兩條路徑中起到了主要作用。之前Brztz等研究發(fā)現(xiàn)，CAP呈劑量依賴性方式舒張豬冠狀動(dòng)脈，其舒張作用可被辣椒平(capsazepine，CPZ)、去內(nèi)皮、NOS 和鉀通道阻斷劑阻斷［11］;Yang等發(fā)現(xiàn)CAP舒張小鼠腸系膜阻力血管作用可被 L-NAME、CGRP8-37阻斷［5］。同時(shí)也存在爭(zhēng)議，Gupta等發(fā)現(xiàn)CAP舒張人和豬的冠狀動(dòng)脈不是通過(guò) CGRP、NK1、NO、TRPV1 受體、電壓敏感性鈣通道、鉀通道或cAMP介導(dǎo)的機(jī)制，而是可能通過(guò)非特異性、非CGRP依賴性機(jī)制［12］。此外，本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究了外源性CGRP舒血管效應(yīng)，證實(shí)了CGRP對(duì)內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管均有濃度依賴性舒張作用，同時(shí)內(nèi)皮完整組優(yōu)于去內(nèi)皮組。提示內(nèi)皮途徑部分參與了舒血管作用，CGRP對(duì)大鼠腸系膜阻力血管的舒張方式是部分內(nèi)皮依賴性。這與之前Brain等研究表明，CGRP對(duì)兔的主動(dòng)脈和腸系膜阻力動(dòng)脈［13］、大鼠主動(dòng)脈［14］、大鼠肺動(dòng)脈［15］、人內(nèi)乳動(dòng)脈［16］內(nèi)皮依賴性舒張方式不同，這可能和種屬、部位器官、血管粗細(xì)差異有關(guān)。CGRP舒張血管方式分為內(nèi)皮依賴性和非內(nèi)皮依賴性［17］，具體機(jī)制目前還不十分清楚，有待進(jìn)一步的研究。

CAP可激活TRPV1受體，引起感覺(jué)神經(jīng)末梢CGRP、SP等血管活性遞質(zhì)的釋放［3-4］。之前研究表明，SP是一種重要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)，能夠把疼痛瘙癢刺激由外周神經(jīng)傳入脊髓神經(jīng)和高級(jí)中樞神經(jīng)［18］;在人冠狀動(dòng)脈中，SP可內(nèi)皮依賴性舒張血管［19］;SP的舒張機(jī)制可能與激活大動(dòng)脈壁上NK1-R受體有關(guān)［20］。但本實(shí)驗(yàn)中，SP對(duì)PE預(yù)收縮的大鼠腸系膜阻力血管未見(jiàn)明顯的舒張反應(yīng)，表明了CAP舒血管效應(yīng)是通過(guò)非SP途徑實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CAP對(duì)大鼠腸系膜動(dòng)脈阻力血管具有濃度依賴性舒張作用，其具體機(jī)制包括兩方面:部分內(nèi)皮依賴性舒張血管，與其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NOS-NO通路有關(guān);另一方面，非內(nèi)皮依賴性舒張血管和CGRP釋放有關(guān)。

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