王 歡，包其郁，孫愛華，趙金方，葛玉梅，嚴 杰

(1.浙江省人民醫(yī)院檢驗科，浙江杭州 310014;2.溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院和生命科學學院，浙江溫州 325035;3.浙江醫(yī)學高等?？茖W校，浙江杭州 310053;4.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，浙江杭州 310006;5.浙江大學醫(yī)學院病原生物學系，浙江杭州 310058）

近年來我國及東南亞地區(qū)臨床耐藥菌株、尤其是耐多種抗生素的多重耐藥菌株的分離率逐年增高，其中大腸埃希菌、陰溝桿菌、不動桿菌等革蘭陰性腸道所占比例較大［1-3］。上述細菌主要引發(fā)醫(yī)院感染，包括呼吸道感染、敗血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎等［4］。

整合子(integron)是細菌基因組中一種介導耐藥基因轉移的轉座元件，其功能與細菌耐藥性產(chǎn)生與轉移密切相關［5-7］。典型的整合子結構由保守區(qū)和可變區(qū)兩部分組成，前者為整合酶編碼基因所在區(qū)域活性，后者由串聯(lián)排列的耐藥基因盒組成，迄今發(fā)現(xiàn)的整合子相關耐藥基因盒至少有數(shù)十種，所含耐藥基因幾乎覆蓋了目前臨床上使用的所有抗菌藥物［8，9］。根據(jù)整合酶序列不同，可將整合子分為六型，其中以Ⅰ類整合子最為常見［10-11］。整合子不僅可通過位點特異性重組的方式捕獲耐藥基因，從而形成多種耐藥基因的組合，同時還可介導耐藥基因在染色體、質粒及轉座子之間移動，導致耐藥基因的水平播散［12-13］。本研究中，我們檢測了臨床標本中分離的大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌的耐藥性，采用PCR及產(chǎn)物測序檢測與分析了上述菌株Ⅰ類整合子可變區(qū)基因盒，同時以二氫葉酸還原酶基因為靶基因對Ⅰ類整合子系統(tǒng)發(fā)生、進化進行分類和比較。

1 材料與方法

1.1 臨床菌株來源與鑒定 參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》標準，采用法國bioMérieux公司VITEK60全自動細菌檢測分析系統(tǒng)及其配套的細菌鑒定卡GPI，從溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床送檢的體液(血液、腹水等)、分泌物(痰液、膿液、傷口分泌液等)標本中分離并鑒定了24株大腸埃希菌(Escherichia coli)、28株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)和24株鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)。

1.2 藥物敏感試驗 采用K-B法并根據(jù)CLSI 2008標準判讀結果。各類抗菌藥物紙片如下:氨芐西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、頭孢替坦(CTT)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)、丁胺卡那(AMI)、慶大霉素(GEN)、妥布霉素(TOB)、環(huán)丙沙星(CIP)、左旋氧氟沙星(LVX)、復方新諾明(SMZ)、泰能(TIE)和呋喃妥因(NIT)。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922株，購自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.3 細菌基因組DNA制備 采用細菌基因組DNA提取試劑盒(GENEray)提取各受試菌株基因組DNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度［14］。

1.4 PCR 以 GenBank中Ⅰ類整合子序列(accession No.:AM939644)為參照，采用Primer Premier 6.0軟件在可變區(qū)兩端保守序列中設計通用引物。引物委托上海Invitrogen公司合成。上游引物序列:5'-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3'，下游引物序列:5'-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3'。采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa)擴增各菌株中Ⅰ類整合子可變區(qū)片段。反應總體積 50μl，內含:2.5 mol/L dNTP、200 nmol/L 各引物、15 mol/L MgCl2、2.5U EXTaq DNA聚合酶、100 ng DNA模板和1×PCR緩沖液(pH 8.3)。PCR參數(shù):95℃ 5 min;94℃1 min、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30 個循環(huán);72℃10 min。采用溴乙錠預染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果。

1.5 擴增產(chǎn)物測序及分析 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BioColor)回收目的擴增片段，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將其克隆至pMD-19T質粒中，然后電轉化入 E.coli DH5α(Invitrogen)并在LB培養(yǎng)液(Oxoid)中擴增，氨芐西林和藍白斑雙重篩選后委托上海Sangong公司測序［14］。采用BLAST軟件對測序結果進行分析和比較。

1.6 進化樹分析 以Ⅰ類整合子中最為常見的二氫葉酸還原酶基因為靶基因，先采用ClustalX1.8軟件與Swissport庫中的不同亞型二氫葉酸還原酶基因序列進行比對，然后采用MEGA系統(tǒng)進化分析軟件中的NJ方法，構建Ⅰ類整合子中二氫葉酸還原酶基因的分子進化樹并進行系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結果

2.1 細菌耐藥率檢測結果 24株大腸埃希菌、28株陰溝腸桿菌、24株鮑曼不動桿菌藥敏試驗結果顯示:三種細菌對多種抗菌藥物耐藥，但鮑曼不動桿菌對大多數(shù)抗生素耐藥率高于大腸埃希菌和陰溝腸桿菌，對哌拉西林(PIP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)及呋喃妥因(NIT)耐藥率甚至高達100%，大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對頭孢曲松頭孢替坦(CTT)、(CRO)和頭孢他啶(CAZ)耐藥率也高達41.6% ～62.5%(表1)。

2.2 Ⅰ類整合子的檢出率 24株大腸埃希菌、28株陰溝腸桿菌、24株鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合子檢出率分別為 62.5%(15/24)、67.9%(19/28)和83.3%(20/24)。見表 2。

2.3 Ⅰ類整合子譜型 54株檢出Ⅰ類整合子菌株(15株大腸埃希菌、19株陰溝腸桿菌和20株鮑曼不動桿菌)中，有44株呈單一陽性條帶，多數(shù)為1.7 kb條帶(25株)，其余為1.5 kb(10株)、0.75 kb(5 株)和 1.0 kb(4 株)條帶(圖1);有5株同時檢出2條帶，分別有0.75/1.70 kb(3 株)、0.75/1.0 kb(1 株)和1.0/1.70 kb(1株)三種組合方式(圖2)。

2.4 Ⅰ類整合子可變區(qū)基因盒分析結果 在11株大腸埃希菌、15株陰溝腸桿菌和15株鮑曼不動桿菌中有5種不同類型的基因盒:分別為 aac(6')、sad(3″)、aad(2″)、cat(4')和 dfr(含7、A13、15 三個亞型)，aac(6')、sad(3″)和 dfr 15能以單基因方式存在，有4種雙基因組合方式、1種三基因組合方式(表3)。aac(6')為(Aminoglycoside N(6')-acetyltransferase)基因，sad(3″)為鏈霉素腺苷酰轉移酶(streptomycin 3″-adenylyltransferase)基因，aad(2″)是 (aminoglycoside nucleotidyltransferase)基因，cat(4')是(chloramphenicol acetyltransferase)基因，可分別介導細菌對氨基糖苷類抗生素及氯霉素耐藥。dfr 7、dfr A13和 dfr 15為二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase)基因可賦予細菌對甲氧芐啶的耐藥性。然而，上述菌株Ⅰ類整合子中未發(fā)現(xiàn)β-內酰胺酶基因。

表1 大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和鮑曼不動桿菌耐藥率Table 1 Resistance rates of E.coli，E.cloacae and A.baumannii

表2 大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和鮑曼不動桿菌I型整合子檢出率Table 2 Positive rates of class-Ⅰ integron in E.coli，E.cloacae and A.baumannii

圖1 Ⅰ類整合子單條帶譜型Fig.1 Spectral patterns of class-Ⅰintegrons with single bands

圖2 Ⅰ類整合子雙條帶譜型Fig.2 Spectral patterns of class-Ⅰ integrons with double bands

3.5 二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生分析結果

上述菌株Ⅰ類整合子所攜帶的二氫葉酸還原酶基因可歸納為4組:①重疊群9(Ctg9)二氫葉酸還原酶基因與15型二氫葉酸還原酶基因接近;②重疊群1和15(Ctg1和Ctg15)二氫葉酸還原酶基因與5型二氫葉酸還原酶基因接近;③重疊群14a和14b(Ctg14a和Ctg14b)二氫葉酸還原酶基因與7型二氫葉酸還原酶基因接近;④重疊群20和21(Ctg20和Ctg21)二氫葉酸還原酶基因與13型二氫葉酸還原酶基因接近(圖3)，提示上述菌株Ⅰ類整合子有4條不同的系統(tǒng)發(fā)生或進化途徑。

表3 Ⅰ類整合子基因盒的構成及其分布Table 3 Composition and distribution of gene cassettes in class-Ⅰintegron

圖3 Ⅰ類整合子中二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tress of dihydrofolate reductase genes in class-Ⅰintegrons

3 討論

大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌是臨床常見的條件致病菌，且這些細菌普遍存在耐藥或多重耐藥現(xiàn)象［1，3，15-16］。與歐美國家或地區(qū)比較，亞洲地區(qū)各種臨床分離菌株對抗生素耐藥率普遍較高，其中大腸埃希菌對頭孢曲松和氧氟沙星耐藥率分別為為67.6%和 65.0%，鮑曼不動桿菌對哌拉西林耐藥率高達70.5%，陰溝腸桿菌對頭孢西丁的耐藥率甚至 高 達 93.7%［1，4，17，18］。我 們的藥物敏感試驗結果顯示，鮑曼不動桿菌耐藥性最強，對臨床常用的三代頭孢類抗生素頭孢曲松(CRO)、頭孢他啶(CAZ)及青霉素類抗生素哌拉西林(PIP)耐藥率為100%，對氨芐西林(AMP)耐藥率也高達70.8%;陰溝腸桿菌對受試的3種三代頭孢類抗生素(CTT、CRO、CAZ)、3 種氨基糖苷類抗生素(AMI、GEN、TOB)和2種喹諾酮類抗生素(CIP、LVX)耐藥率高達 46.4% ～71.4%，明顯高于大腸埃希菌(表1)，表明臨床上耐藥菌株流行狀況已十分嚴重。細菌的耐藥機制十分復雜，僅基因突變和耐藥質粒已無法完全解釋細菌快速獲得耐藥性的現(xiàn)象。整合子可捕獲耐藥基因并通過整合酶將其整合后表達，使細菌產(chǎn)生耐藥性，又能介導耐藥基因轉移，為深入研究細菌耐藥及播散機制提供了新方向［9］。整合子分成兩大群:可移動整合子和超級整合子［8］。可移動整合子又被分成五類(Ⅰ～Ⅴ)，不同整合子類型中基因盒數(shù)目不盡相同，也非所有基因盒均可介導耐藥性?？梢苿英耦愓献訌V泛地分布于寄生性和腐生性菌株中，在革蘭陰性臨床菌株中，Ⅰ類整合子更為常見且有較高的耐藥基因攜帶率［10，13，19］。超級整合子基因盒中除耐藥基因外，還包含許多參與環(huán)境適應的功能蛋白編碼基因。我們的實驗結果顯示，大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動桿菌中Ⅰ類整合子總檢出率高達71.1%(54/76)，其中鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合子檢出率(83.3%)高于大腸埃希菌(62.5%)和陰溝腸桿菌(67.9%);各菌株攜帶的Ⅰ類整合子有高度異質性，表現(xiàn)為不同大小單條帶或雙條帶組合多種譜型，提示這些菌株Ⅰ類整合子功能活躍。

大多數(shù)耐藥基因盒由Ⅰ類整合子攜帶，包括β-內酰胺類(青霉素類、頭孢菌素類)、喹諾酮類、大環(huán)內酯類和喹諾酮類及磺胺類抗性基因［8，9］。然而，我們在實驗中僅發(fā)現(xiàn) aac(6')、sad(3″)、aad(2″)、cat(4')、dfr(7、A13 和 15 亞型)等與氨基糖苷類、氯霉素和磺胺類耐藥有關基因，未發(fā)現(xiàn)β-內酰胺酶基因，但受試的鮑曼不動桿菌對β-內酰胺類抗生素(AMP、PIP、CRO、CAZ、CTT)耐藥率高達 54.2% ～100%，陰溝腸桿菌和大腸埃希菌對頭孢菌素類抗生素(CRO、CAZ、CTT)耐藥率也分別高達46.4% ～50%和41.6% ～62.5%，這提示上述菌株對 β-內酰胺類抗生素的耐藥性可能涉及基因突變和耐藥質粒等其他耐藥機制，與Ⅰ類整合子無關。

在各種抗生素廣泛使用的情況下，細菌的耐藥性基因也在不斷發(fā)生變化并逐漸發(fā)展出不同的基因型。例如，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超廣譜β內酰胺酶即有數(shù)百種不同的基因型，僅CTM-X就有近60個型別［21］，介導磺胺類耐藥的二氫葉酸還原酶基因也有近20個基因型［22］。本研究中I型整合子基因盒主要結構基因二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生的分析結果顯示，所發(fā)現(xiàn)的二氫葉酸還原酶基因可分成4組，分別與15型、5型、7型和13型二氫葉酸還原酶基因接近，提示在藥物選擇性壓力下，Ⅰ類整合子有4條不同的系統(tǒng)發(fā)生或進化途徑，所攜帶的二氫葉酸還原酶基因呈現(xiàn)為多樣性。

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