李小余，王銀環(huán)，嚴 杰，程東慶

(1.浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江 杭州 310053;2.浙江大學醫(yī)學院病原生物學系，浙江 杭州 310058)

由致病性鉤端螺旋體(Leptospira)(簡稱鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的人獸共患傳染病，我國是該病的主要疫區(qū)之一［1-2］。鉤體病通過疫水迅速傳播，極易引起暴發(fā)流行，故鉤體病是我國重點監(jiān)控的傳染病之一。致病性鉤體自然宿主和血清群眾多，僅我國即有18個血清群，但各血清群之間交叉保護作用弱或無［3］。目前使用的鉤體疫苗均為當?shù)亓餍袉柼栥^體血清群、型制備的多價全菌死疫苗，但該疫苗對其未包含的鉤體血清群感染無保護作用，同時全菌疫苗副作用很大［4-6］。因此研發(fā)高效低毒的通用型鉤體基因工程疫苗具有重要意義。

研發(fā)通用型鉤體基因工程疫苗的前提是篩選出不同血清群型中普遍存在的屬特異性保護抗原。早年發(fā)現(xiàn)，鉤體外膜總蛋白具有交叉免疫保護作用［7］。近年文獻報道，LipL32、LigB、Loa22和OmpL1等外膜蛋白是屬特異性抗原［8-11］，但此類蛋白分子量過大或存在不同的基因型［9，12-13］。GroEL 是細菌熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)家族成員，序列保守，有很強的免疫原性［14-16］。在問號鉤體賴株染色體中也存在編碼 groEL基因［17］，且其表達產(chǎn)物GroEL是外膜蛋白［18-19］。因此，GroEL 蛋白有可能作為鉤體基因工程疫苗抗原。本研究中，我們檢測了我國優(yōu)勢流行鉤體血清群中g(shù)roEL基因，重組表達了問號鉤體賴型賴株GroEL蛋白并進行了動物保護性試驗，以期為GroEL作為通用型鉤體基因工程疫苗抗原提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 鉤體株及培養(yǎng) 我國用于鉤體病血清學診斷的標準株問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株由浙江大學醫(yī)學院病原生物學系提供，采用EMJH培養(yǎng)基在28℃條件下培養(yǎng)。

1.2 groEL基因擴增 采用 (Generay)提取問號鉤體賴株DNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度［20］。根據(jù) GenBank上問號鉤體賴株groEL 基因序列(accession No.:NC_004342)及其限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果、原核表達載體pET42a(Novagen)多克隆位點，設(shè)計擴增全長groEL基因并攜帶合適內(nèi)切酶位點的引物。上游引物序列:5'-CGC CAT ATG(Nde I)GCG AAA GAT ATT GAA-3'，下游引物序列:5'-CGC CTC GAG(Xho I)CAT CAT TCC GCC CAT TCC。引物由上海 Invitrogen公司合成。采用高保真PCR試劑盒(TaKaRa)擴增groEL基因，PCR 總體積 100 μl，內(nèi)含 2.5 mol/L dNTP、200 nmol/L 各引物、20 mol/L MgCl2、2.5 U EX-Taq DNA聚合酶、100 ng DNA模板和1×PCR緩沖液(pH8.3)。PCR參數(shù):94℃ 5 min;94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 120 s，30 個循環(huán);72℃ 10 min。采用溴乙錠預染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。

1.3 擴增產(chǎn)物測序及分析 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(BioColor)回收groEL基因擴增片段，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將其克隆至pMD-19T質(zhì)粒中，形成 pMD-19TgroEL后電轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α(Invitrogen)并在 LB培養(yǎng)液(Oxoid)中擴增，氨芐西林和藍白斑雙重篩選，質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)提取重組質(zhì)粒后采用Nde I和 Xho I(TaKaRa)雙酶切初步鑒定［20］，委托上海 Invitrogen 公司測序。采用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和 TMpredServer(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)中軟件對GroEL結(jié)構(gòu)進行分析。

1.4 groEL基因原核表達系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定采用Nde I和Xho I分別雙酶切pMD19-TgroEL和pET42a，在T4 DNA連接酶(TaKaRa)作用下，將回收的groEL基因片段連接于線性化pET42a，形成重組表達載體 pET42agroEL。將pET42agroEL電轉(zhuǎn)化入表達宿主菌 E.coli BL21DE3(Novagen)，獲得工程菌E.coli BL21DE3pET42a-groEL，質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)提取質(zhì)粒后再次測序［20］。

1.5 目的重組蛋白表達與純化 E.coli BL21DE3pET42a-groEL接種于含50 μg/mL卡那霉素(Sigma)的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A600=0.6～0.8時加入終濃度為0.5 mmol/L的 IPTG(Sigma)，以誘導目的重組蛋白GroEL(rGroEL)表達。培養(yǎng)物10000 r/min 4℃離心5 min，細菌沉淀用 0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌2次，冰浴中超聲破碎，5000 r/min 4℃離心10 min，取上清和沉淀備檢。采用10%分離膠的SDS-PAGE聯(lián)合Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查rGroEL表達情況及狀態(tài)，然后用 Ni-NTA親和層析柱(BioColor)提純可溶性rGroEL［21］。提純的rGroEL采用試劑盒(Beyotime)測定其蛋白濃度。

1.6 rGroEL抗血清的制備 2 mg提純的rGroEL與弗氏完全佐劑充分混勻，間隔一周背部多點皮內(nèi)注射新西蘭家兔4次。末次免疫兩周后采集家兔心血，分離血清。采用 1 μg rGroEL為包被抗原的ELISA檢測抗血清效價，其吸光度大于相同稀釋度正常兔血清OD450均值+3SD 者判為陽性［22］。

1.7 rGroEL 免疫反應性檢測:200 μg rGroEL SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Life Sciences)上。以1∶2500 稀釋的rGroEL兔抗血清或1∶500稀釋的鉤體病病人血清為一抗、1∶10000 稀釋的HRP標記羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)為二抗，采用 Western Blot法檢測rGroEL與上述血清標本的免疫反應性。

1.8 金地鼠保護試驗 4周齡雄性金地鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。新鮮培養(yǎng)的問號鉤體賴株12000 r/min離心15 min(4℃)，沉淀的鉤體用不同體積的EMJH培養(yǎng)液重懸，Petroff-Hausser counting chamber計數(shù)板(Fisher Scientific)計數(shù)［23］。先將金地鼠分為5組，每組6只，其中4組分別腹腔注射107、108、109或1010問號鉤體賴株懸液1 mL，觀察7 d，另一組注射等體積EMJH培養(yǎng)液作為對照，以確定最低致死量(MLD)。將金地鼠分為3組，每組8只，其中兩組分別腹股溝皮下注射100 μg 或 200 μg rGroEL 與 1 mg 氫氧化鋁(Sigma)混合物，間隔一周重復免疫一次，另一組注射200 μg BSA(Sigma)與氫氧化鋁混合物作為對照［12］。末次免疫后兩周，用2倍 MLD問號鉤體賴株腹腔注射進行攻擊，觀察7 d。上述實驗動物飼養(yǎng)溫度21±2℃，相對濕度30%～70%，光照周期14/10 h。

1.9 顯微鏡凝集試驗(MAT) 采集上述動物保護試驗中存活的rGroEL免疫金地鼠心血，分離血清。血清用 PBS 進行 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 稀釋，取 0.1 ml與等量新鮮培養(yǎng)的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株混合，37℃孵育1 h，然后在暗視野顯微鏡下觀察，以50%鉤體被凝集的血清最高稀釋度作為效價判斷終點。實驗中用正常金地鼠血清作為對照。

2 結(jié)果

2.1 groEL基因分布 從問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株基因組DNA中均擴增出預期大小的groEL基因片段(圖1)。

圖1 不同問號鉤體血清群groEL基因擴增片段Fig.1 Amplification fragments of groEL gene of different L.Interrogans serogroups

2.2 groEL基因測序與結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 與GenBank(accession No.:NC_004342)中問號鉤體賴株groEL基因比較，本實驗所克隆的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株groEL基因核苷酸和氨基酸序列相似性達99.5%以上。基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，GroEL為外膜蛋白，N端位于胞外，跨膜區(qū)序列為MAKDIEYNETARRKLLE，無胞內(nèi)區(qū)(圖2)。

2.3 rGroEL表達及其抗血清效價 在IPTG誘導下，所構(gòu)建的原核表達系統(tǒng) E.coli BL21DE3pET42a-groEL能有效表達rGroEL，該重組蛋白主要以可溶性形式存在，提純的rGroEL經(jīng)SDS-PAGE后顯示為單一的蛋白條帶(圖3)。

圖2 鉤體GroEL蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.2 Results of structural analysis of leptospiral GroEL protein

圖3 rGroEL蛋白表達和提純效果Fig.3 Expression and purification effects of rGroEL protein

2.4 rGroEL免疫原性 兔抗 rGroEL血清ELISA效價為1∶5000 。Western Blot結(jié)果顯示，rGroEL可被兔抗rGroEL血清及鉤體病患者血清識別并產(chǎn)生結(jié)合反應(圖4)。

2.5 rGroEL免疫保護效果 問號鉤體賴株對金地鼠MLD為108。2倍MLD問號鉤體賴株攻擊后，100與200 μg rGroEL免疫的金地鼠存活率分別為 50.0%(4/8)和75.0%(6/8)。

圖4 rGroEL與不同血清標本W(wǎng)estern Blot結(jié)果Fig.4 Western BlotresultofrGroEL with different serum specimens

2.6 MAT效價 rGroEL免疫金地鼠血清與問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株的 MAT效價為1∶50～1∶400(表2)。

3 討論

除新疆、西藏、青海、甘肅、寧夏省區(qū)至今尚未有鉤體病例報道外，其余我國省區(qū)均存在不同程度的鉤體病流行狀況，其中四川、湖北、湖南等長江流域及嶺南地區(qū)鉤體病流行較為嚴重［2-3］。我國流行的主要問號鉤體血清群為黃疸出血群、流感傷寒群、秋季群、波摩那群、澳洲群、七日熱群和犬群，其中60% ～70%的鉤體病病人為感染黃疸出血群賴型所致［2-3］。廣東、廣西、四川、江西等地區(qū)曾發(fā)生塞羅群棉蘭型鉤體感染所致的鉤體病暴發(fā)流行［3］。

表1 rGroEL對金地鼠免疫保護效果Table 1 Immunoprotective effect of rGroEL in LVG hamsters

表2 rGroEL免疫金地鼠血清MAT檢測結(jié)果Table 2 Detection result of sera from rGroEL-immunized LVG hamsters by MAT

接種疫苗是預防和控制傳染病流行最為有效和經(jīng)濟的措施。現(xiàn)行使用的多價鉤體全菌死疫苗雖對其所包含的鉤體血清群感染有一定的保護作用，但接種后常有發(fā)熱、接種部位淋巴結(jié)腫大等嚴重不良反應，一般認為該毒副作用由鉤體細胞壁 LPS引起［3，12-13］。由于易感人群主要是農(nóng)民，上述多價鉤體全菌死疫苗接種后往往數(shù)天內(nèi)不能進行重體力勞動，使疫苗預防接種受到了很大限制。多價鉤體全菌死疫苗另一重大缺陷是，對疫苗中未包含的問號鉤體血清群無交叉免疫保護作用，這也是近年來廣東、廣西、四川、江西等地區(qū)塞羅群棉蘭型暴發(fā)流行的主要原因［2-3］。

GroEL是一種熱休克蛋白，廣泛存在于多種原核細胞型微生物，在新生蛋白正確折疊和組裝、變性蛋白質(zhì)修復、蛋白跨膜轉(zhuǎn)移過程中起重要作用［14-16］。有文獻報道，問號鉤體秋季型GroEL 位于鉤體外膜表面［18-19，24］，是誘導宿主體液免疫反應的主要抗原，鉤體病病人血清中可檢出GroEL抗體［25］。我們的蛋白分子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，GroEL確為外膜蛋白，其96.9%(17/546)序列位于菌體外。

我們以往研究中發(fā)現(xiàn)，問號鉤體賴株感染巨噬細胞后，LipL32等不少外膜蛋白表達水平顯著下降，但GroEL表達水平顯著升高［26-27］。我們的實驗結(jié)果顯示，問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、澳洲群澳洲型65-9株、七日熱群七日熱型56069株、犬群犬型林株、塞羅群烏爾夫型L183株都有g(shù)roEL基因且其序列高度保守。除幼豚鼠外，金地鼠是致病性鉤體的易感動物［28］。本研究中，我們探討了rGroEL蛋白對金地鼠的免疫保護作用，結(jié)果顯示100與200 μg rGroEL免疫的金地鼠存活率分別為50.0%和75.0%(表1)。此外，rGroEL免疫金地鼠血清對上述8群8株問號鉤體的MAT效價為1∶50～1∶400(表2)。綜上所述，GroEL是分布廣泛、序列保守、抗原性較強的問號鉤體屬特異性保護性抗原，可用于研制通用性鉤體基因工程疫苗。

［1］BHARTI A R，NALLY J E，RICALDI J N，et al.Leptospirosis:a zoonotic disease of global importance［J］.Lancet Infect Dis，2003，3(12):757-771.

［2］ZHANG C L，WANG H，YAN J.Leptospirosis prevalence in Chinese populations in the last two decades［J］.Microbes Infect，2012，14(4):317-323.

［3］YAN Jie，DAI Baoming，YU Enshu(嚴 杰，戴保民，于恩庶).Leptospirology(鉤端螺旋體病學)［M］.Third Edition，Beijing:The People's Healthy Publication House，China，2006.(in Chinese)

［4］SUN Baili，GUO Zongqi，LUO Dongjiao(孫百莉，郭宗琪，羅冬嬌，等)，et al.Membrane location and naturally antibody responses of genus-specific antigen OmpLls of Leptospira interrogans［J］.Acta Microbiol Sin(微生物學報)，2007，47(2):329-334.(in Chinese)

［5］LUO Dongjiao，YAN Jie，MAO Yafei(羅冬嬌，嚴杰，毛亞飛，等)，et al.Construction and application ofprokaryotic expression system ofLeptospira interrogans lipL32/1-lipL41/1 fusion gene ［J］.JournalofZhengjiang University:Medical Sciences(浙江大學學報:醫(yī)學版)，2005，34(1):27-32.(in Chinese)

［6］YAN Jie(嚴 杰).ProgressofLeptospira pathogenic mechanismsand new vaccinesand bacterial drug resistance ［J］.Journal of Zhengjiang University:Medical Sciences(浙江大學學報:醫(yī)學版)，2008，37(6):537-543.(in Chinese)

［7］SONRIER C，BRANGER C，MICHEL V，et al.Evidence ofcross-protection with in Leptospira interrogans in an experimental model［J］.Vaccine，2000，19(1):86-94.

［8］HAAKE D A，CHAO G，ZUERNER R L，et al.The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection［J］.Infect Immun，2000，68(4):2276-2285.

［9］JULIO C，CLAUDIO P F，ELSIO A W J，et al.Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species:Disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis［J］.Infect Immun，2008，76(12):5826-5833.

［10］PICARDEAU M，BULACH D M，BOUCHIER C，et al.The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence ［J］.PLoS Pathog，2007，3(7):0894-0903.

［11］HAAKE D A，CHAMPION C I，MARFINCH C，et al.Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1，a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp［J］.J Bateriol，1993，175(13):4225-4234.

［12］LUO D J，XUE F，OJCIUS D M，et al.Protein typing of major outer membrane lipoproteins from Chinese pathogenic Leptospira spp. and characterization of their immunogenicity ［J］.Vaccine，2010，28(1):243-255.

［13］DONG H Y，HU Y，XUE F，et al.Characterization of the ompL1 gene of pathogenic Leptospira species in China and cross-immunogenicity of the OmpL1 protein ［J］.BMC Microbiol，2008，8:223.

［14］KHAN M，SHUKLAD，BANSALA，etal.Immunogenicity and protective efficacy of GroEL(hsp60)of Streptococcus pneumoniae against lethal infection in mice ［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2009，56(1):56-62.

［15］NOAH C E，MALIK M，BUBLITZ D A C，et al.GroEL and lipopolysaccharide from Francisella tularensis live vaccine strain synergistically activate human macrophages［J］.Infect Immun，2010，78(4):1797-1806.

［16］LIN J S，MARK A W.Escherichia coli thioredoxinlike protein YbbN contains an atypical tetratricopeptide repeat motif and is a negative regulator of GroEL ［J］.J Biol Chem，2011，286(22):19459-19469.

［17］REN S X，F(xiàn)U G，JIANG X G，et al.Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing［J］.Nature，2003，422(6934):888-893.

［18］NATARAJASEENIVASAN K，ARTIUSHIN S C，VELINENI S，et al.Surface-associated Hsp60 chaperonin of Leptospira interrogans serovar Autumnalis N2 strain as an immunoreactive protein［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30(11):1383-1389.

［19］LO M，CORDWELL S J，BULACH D M，et al.Comparative transcriptional and translational analysis of leptospiral outer membrane protein expression in response to temperature［J］.PLoS Negl Trop Dis，2009，3(12):e560.

［20］SAMBROOK J，F(xiàn)RITSCHEF，MANIATIST.Molecular Cloning:A LaboratoryManual［M］.2nd edition，New York:Cold Sping Harbor Labooratory Press，1989，1.21-1.52，2.60-2.80，7.3-7.35，9.14-9.22.

［21］XU Lihui，YAN Jie，RUAN Ping(徐麗慧，嚴杰，阮 萍，等)，et al.Immune-functional epitopes and inflammation-inducing effects of the major outer envelope proteins of Leptospira interrogans［J］.Journalof Zhengjiang University:Medical Sciences(浙江大學學報:醫(yī)學版)，2005，34(1):9-14.(in Chinese)

［22］LEWIS S M， OSEI-BIMPONG A.Haemoglobinometry in general practice［J］.Clin Lab Haematol，2003，25(6):343-346.

［23］SCHREIER S，TRIAMPO W，DOUNGCHAWEE G，et al.Leptospirosis research:fast，easy and reliable enumeration of mobile leptospires［J］.Biol Res，2009，42(1):5-12.

［24］CULLEN P A，XU X，MATSUNAGA J，et al.Surfaceome of Leptospira spp［J］.Infect Immun，2005，73(8):4853-4863.

［25］PARK S H，AHN B Y，KIM M J.Expression and immunologic characterization of recombinant heat shock protein 58 of Leptospira species:a major target antigen of the humoral immune response［J］.DNA Cell Biol，1999，18(12):903-910.

［26］SUN Pingping，LIN Xv'ai，LI Liwei(孫萍萍，林旭璦，李 立 偉，等)，etal.Diversityofouter membrane protein expression of Leptospira interrogans during infection ofhuman THP-1 monocytes ［J］. Chinese Journal of Microbiology and Immunology(中華微生物學與免疫學雜志)，2012，32(3):224-231.(in Chinese)

［27］XUE F，DONG H Y，WU J Y，et al.Transcriptional responses of Leptospira interrogans to host innate immunity:Significantchangesin metabolism，oxygen tolerance，and outer membrane ［J］.PLoS Negl Trop Dis，2010，4(10):e857.

［28］ATZINGEN M V，VIEIRA M L，OLIVEIRA R，et al.Evaluation of immunoprotective activity of six leptospiral proteinsin the hamstermodelof leptospirosis［J］.Open Microbiol J，2012，6(1):79-87.