陳艷翠，黃思齊，李建軍，唐慧娟，陳安國，李德芳

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長沙，410205)

引言

紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是錦葵科木槿屬一年生速生纖維作物，適應(yīng)性廣，除了傳統(tǒng)的用途之外，現(xiàn)在主要對(duì)其進(jìn)行多功能用途開發(fā)，例如用來制作紙漿、墻布、麻地膜、飼料等，被認(rèn)為是21世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ亩嘤猛咀魑铮?］。

利用雜交優(yōu)勢是提高紅麻產(chǎn)量的有效方法。自從2003～2004年中國農(nóng)科院麻類所紅麻育種課題在海南三亞南繁基地發(fā)現(xiàn)了質(zhì)核互作型紅麻雄性不育株后，有效的避免了在雜交優(yōu)勢利用中化學(xué)殺雄以及人工去雄的劣勢［2］。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，了解紅麻雄性不育的機(jī)理對(duì)于利用雜交優(yōu)勢進(jìn)行紅麻雜交制種具有重要意義。

分離、鑒定和克隆與雄性不育相關(guān)的基因以及對(duì)其某些功能性區(qū)域進(jìn)行分析，是深入研究雄性不育的必然途徑［3］。在已經(jīng)鑒定的各種植物的雄性不育基因中，許多雄性不育基因涉及了ATP合成酶基因［4］。ATP合酶是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶，參與氧化磷酸化與光合磷酸化反應(yīng)，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢的推動(dòng)下催化合成生物體的能量ATP［5］。李友勇的研究指出在BNS溫敏性小麥雄性不育轉(zhuǎn)化系中發(fā)現(xiàn)，ATP合酶α和β亞基、胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶、線粒體醛脫氫酶亞基、Rubisco亞基等呼吸、光合能量代謝蛋白表達(dá)豐富，但在不育系中這些蛋白缺失或下調(diào)［6］。Mineo Senda等對(duì)油菜ATP合酶α亞基基因的基因組結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)該基因的編碼區(qū)是一樣的，而在起始密碼子之前和終止密碼子之后存在差異［7］。除此之外，C.D.chase以及Per Bergman等的研究分別在菜豆和煙草中發(fā)現(xiàn)在atp1基因編碼序列附近有存在一個(gè)與atp1基因共轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框，使得基因的表達(dá)在不育和可育之間產(chǎn)生差異［8-10］。這些現(xiàn)象都表明ATP合成酶基因可能在植物不育中起到了一定的作用。

目前，紅麻的ATP合成酶基因并未克隆，克隆并研究紅麻中的ATP合成酶基因，可以在一定程度上揭示紅麻雄性不育的機(jī)理，同時(shí)為紅麻雜種優(yōu)勢利用打下基礎(chǔ)［11-13］。

1 材料與方法

1.1 材料

紅麻不育系品種261N5-19A對(duì)應(yīng)的保持系261N5-19B，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所紅麻育種課題選育而成。

RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司;DNA marker購自天根公司;rTaq DNA聚合酶、KOD-neoplus購自ToYoBo公司;瓊脂糖(Biowest公司);5×TBE緩沖液;10 mg/mL EB;切膠回收試劑盒購自AxyGen公司;5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends試劑盒購自Invitrogen公司;SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司;引物合成及序列測序均由上海生工公司完成。

1.2 紅麻幼苗RNA的提取

將紅麻保持系種子于28℃、光照0%下培養(yǎng)4～6天待用。

RNA提取所用的槍頭、Eppendorf管浸泡過夜，高溫高壓滅菌，烘干待用;其他玻璃器皿、研缽等按照分子克隆介紹的方法處理。RNA提取具體方法參照Omega公司的RNA提取試劑盒。RNA經(jīng)分光光度計(jì)測定濃度和純度，并跑電泳檢測完整性。

1.3 atp1基因中間片段的擴(kuò)增

將不同物種中的atp1基因的CDS區(qū)序列經(jīng)DNAssist進(jìn)行序列比對(duì)之后，取比較保守的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物序列如下:上游atp F:5’-GGTCGAGTGGTCTCAGTTGGAG;

下游atp R:5’-TCTAGTGGCATTCGATCACAGAA。以紅麻保持系RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，采用50μl PCR 反應(yīng)體系，首先94℃預(yù)變性3min，然后以94℃ 30s、51℃ 30s、72℃1min為一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次，最后72℃延伸6min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以蒸餾水為模板。

反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，并切膠回收。將回收片段與pGEM-T easy進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，搖菌涂平板。檢測菌落，得到的陽性克隆送公司測序。

1.4 RACE進(jìn)行atp1基因5’端和3’端的擴(kuò)增

根據(jù)得到的中間片段序列分別設(shè)計(jì)5’和3’端的特異引物，分別如下:

5'R638-1:CAAAGACAACAATCCCT 3'363-1:CGAAGTGGCCGCCCTTGCTCAATTTG 5'R638-2:AACGCTATTCCTTTCACACCG 3'363-2:GTGCAAGGCTTACAGAAGTACCGAAAC 5'R638-3:TTCCCCAGCTTGAATCTCGTT 3'363-3:CTGTCAATGGATTCTGTGATCGAATGCC

以紅麻保持系RNA為模板，分別按照5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends試劑盒以及SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒完成atp1基因5’端和3’端序列的擴(kuò)增。

反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，并分別切膠回收。將回收片段分別與pGEM-T easy進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，搖菌涂平板。檢測菌落，得到的陽性克隆分別送公司測序。

1.5 atp1基因全長的拼接

將得到的atp1基因的中間片段序列以及5’、3’端序列進(jìn)行拼接，得到atp1基因的全長。根據(jù)拼接的序列預(yù)測可能的CDS區(qū)。

1.6 atp1基因CDS區(qū)全長的擴(kuò)增

根據(jù)預(yù)測的CDS區(qū)的起始密碼子以及終止密碼子附近設(shè)計(jì)引物，引物序列如下:QC638F:GGAACTCTTTATGGAATTCTCTC;QC638R:CTTCATCACATCATAGGTAAGGC。然后以紅麻保持系幼苗的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，采用50μl的PCR反應(yīng)體系，首先94℃預(yù)變性3min，然后以94℃ 30s、52℃ 30s、72℃ 75s為一個(gè)循環(huán)重復(fù)30次，最后72℃延伸6min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，以蒸餾水為模板。

反應(yīng)完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，并切膠回收。將回收片段與pGEM-T easy進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，搖菌涂平板。檢測菌落，得到的陽性克隆送公司測序。

1.7 生物信息學(xué)分析

(1)與atp1基因CDS區(qū)同源的序列通過GenBank的BLAST進(jìn)行;

(2)同源序列之間的比對(duì)通過DNAssist軟件完成;

(3)進(jìn)化樹的構(gòu)建:首先通過Clustal X(版本1.8)完成多序列的比對(duì)，然后由MEGA4軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻幼苗RNA的提取

提取的RNA首先在分光光度計(jì)下檢測，D260nm/D280nm值在1.8左右，表明其純度較高。然后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，于紫外燈下觀察并拍照記錄，如圖1所示。

圖1 紅麻幼苗RNAFig.1 RNA of kenaf(Hibiscus cannabinus)seedling

由圖1.可以看出，提取的RNA有很明顯的18S和28S兩條清晰的條帶，且兩條條帶 (28 sRNA:18 sRNA)的亮度比約為2:1，因此可以用來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。(圖中所用marker為200bp ladder)

2.2 中間片段的擴(kuò)增

通過對(duì)不同物種中atp1基因序列的比對(duì)分析之后，發(fā)現(xiàn)該基因的保守性很高，所以直接根據(jù)保守部分的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物(atp F，atp R)，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物電泳如圖2.所示，該片段經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序以及去載體之后，實(shí)際大小為1295bp。

2.3 atp1基因5’端和3’端序列的擴(kuò)增

由得到的atp1基因中間片段序列設(shè)計(jì)5’端擴(kuò)增的R638-1、R638-2和R638-3以及3’端擴(kuò)增的363-1、363-2和363-3特異引物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測如圖3、圖4所示，片段經(jīng)切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序以及去載體后，實(shí)際大小5’端為374bp，3’端為897bp。

圖2 擴(kuò)增得到的中間片段 圖3.擴(kuò)增得到的5’端序列 圖4.擴(kuò)增得到的3’端序列Fig.2 Intermediate fragments Fig.3 5’end sequences Fig.4 3’end sequences

2.4 atp1基因全長拼接以及CDS區(qū)預(yù)測

將實(shí)驗(yàn)所得的中間片段以及5’3’序列經(jīng)DNAssist軟件比對(duì)，通過重疊區(qū)域拼接，得到atp1基因的全長，共有2315bp。預(yù)測的CDS區(qū)全長為1524bp，在5’端216位存在起始密碼子ATG;3’端的第1737位存在終止密碼子TGA;3’末端存在poly(A)尾巴。

2.5 全長CDS區(qū)序列的擴(kuò)增及測序

根據(jù)預(yù)測的CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物(QC638F，QC638R)，擴(kuò)增紅麻保持系中atp1基因的CDS區(qū)序列，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠回收，與載體連接并轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌中，檢測的陽性克隆送公司測序。實(shí)際得到的序列與拼接預(yù)測的ORF一致，大小為1524bp，編碼508個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為55.1KD，等電點(diǎn)為6.23。

2.6 基因序列分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

為研究不同物種中atp1基因的同源性以及進(jìn)化關(guān)系，從GenBank下載了胡蘿卜等物種中的atp1基因序列進(jìn)行同源性分析以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，不同物種中的atp1基因的序列同源性為94%～98%。這表明在不同物種中atp1基因的序列比較保守。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)發(fā)現(xiàn)，與紅麻atp1基因進(jìn)化關(guān)系較近的是大豆。

3 討論

本研究以紅麻質(zhì)核互作型雄性不育保持系為材料，利用同源克隆與RACE結(jié)合的方法擴(kuò)增得到質(zhì)核互作型紅麻保持系中的atp1基因。首次在紅麻中克隆得到ATP合酶α亞基的編碼基因atp1基因。

將紅麻保持系atp1基因的CDS區(qū)序列與其他物種中的同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，可以看出:紅麻atp1基因與其他物種中的同一基因同源性較高，但是在基因的5’和3’端序列差異較明顯，這可能與物種之間的特異性有關(guān)。得到保持系中的atp1基因序列之后，為下一步克隆紅麻雄性不育系

atp1 ， 、紅麻植物雄性不育的調(diào)控機(jī)理。

圖5 不同物種中atp1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of gene atp1of 26 species

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