（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

多巴胺受體 D5（dopamine receptor D5，DRD5）基因存在單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），為探討其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值，本研究調(diào)查DRD5基因啟動(dòng)子區(qū) rs77434921，5′-UTR區(qū)的rs2076907以及編碼區(qū)的rs6283、rs1800762共4個(gè)SNP位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體中的頻率分布，以探討其法醫(yī)學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 樣本

中國(guó)北方漢族無(wú)血緣關(guān)系的健康人血液樣本206例，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清教研室提供。酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)

DRD5有兩個(gè)假基因 DRD5Ψ1和 DRD5Ψ2，三者具有95%的同源性[1]，本研究結(jié)合美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)，利用軟件Oligo 6.0設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

PCR體系為20μL的LA Taq?酶緩沖體系（大連寶生物工程有限公司），包括模板約10ng，2×GC緩沖液Ⅰ 10μL，2.5mmol/L dNTP 1.5μL，10μmol/L 上、下游引物各1.5μL，LA Taq 1U，滅菌去離子水補(bǔ)足。啟動(dòng)子區(qū)（2163bp）反應(yīng)條件為94℃ 3min；94℃ 1min，61℃ 45s，72℃ 2min，循環(huán) 33 次。編碼區(qū)（922bp）反應(yīng)條件為 94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 40 s，72℃1min，循環(huán)30次。

PCR產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增后委托華大基因有限公司進(jìn)行序列分析。

1.4 多態(tài)性分析與數(shù)據(jù)處理

采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，對(duì)基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，用Haploview v4.1軟件分析rs77434921、rs2076907、rs6283、rs1800762 的連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）關(guān)系，按文獻(xiàn)[2]介紹的方法計(jì)算群體遺傳學(xué)參數(shù)，包括多態(tài)信息含量（PIC）、個(gè)體識(shí)別率（DP）、偶合率（Pm）、非父排除率（PE）、期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）。

2 結(jié) 果

2.1 DRD5基因4個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分布

206例中國(guó)北方漢族個(gè)體DRD5基因的4個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分布見(jiàn)表2。經(jīng)χ2檢驗(yàn)表明4個(gè)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），rs2076907 與 rs6283的 DP 值較高，相關(guān)的群體遺傳學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表2 中國(guó)北方漢族群體DRD5基因4個(gè)SNP等位基因及其基因型頻率 （n=206）

表3 中國(guó)北方漢族群體DRD5基因4個(gè)SNP的群體遺傳學(xué)參數(shù)

2.2 DRD5基因4個(gè)SNP的單倍型與連鎖關(guān)系分析

本研究共檢出5種單倍型（表4），應(yīng)用Haploview v4.1軟件進(jìn)行分析，可見(jiàn)3個(gè)位點(diǎn)顯示出連鎖不平衡。經(jīng)計(jì)算群體遺傳學(xué)參數(shù)，得到單倍型的DP為0.651，PE為0.455。

表4 中國(guó)北方漢族群體DRD5基因的單倍型與頻率

3 討 論

人類DRD5基因位于4p16.1，全長(zhǎng)2398bp，僅有一個(gè)外顯子，可編碼477個(gè)氨基酸[3]。目前為止，美國(guó)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)共報(bào)道了136個(gè)SNP位點(diǎn)，主要分布在啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)。本研究對(duì)206例中國(guó)北方漢族健康無(wú)關(guān)個(gè)體位于啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)的4個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性分析，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。同時(shí)通過(guò)對(duì)上述4個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率及群體遺傳學(xué)參數(shù)的計(jì)算，表明位于5′-UTR區(qū)的rs2076907和編碼區(qū)的rs6283基因型和等位基因頻率分布較好，并且二者的DP值均大于0.5，雜合度（He、Ho）相對(duì)良好，屬于具有較高鑒別能力的遺傳標(biāo)記，較適合應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。而另外兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs77434921和rs1800762基因型和等位基因頻率分布較差。定位在同一染色體上或距離較近的SNP常常會(huì)出現(xiàn)連鎖遺傳現(xiàn)象。從上述數(shù)據(jù)可以看出，本研究所選的4個(gè)SNP位點(diǎn)處于連鎖不平衡狀態(tài)，通過(guò)計(jì)算單倍型的群體遺傳學(xué)參數(shù)，得到了相應(yīng)的DP和PE值，DP值大于0.5，屬于具有較高鑒別能力的遺傳標(biāo)記，可用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別與親權(quán)鑒定。

將本研究調(diào)查結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的人群進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)rs2076907位點(diǎn)在歐洲人群及南非人群中CC型未檢出，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析顯示，中國(guó)北方漢族群體與該人種和群體之間的基因型和等位基因頻率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）[4]；同時(shí)位點(diǎn)rs1800762在中國(guó)北方漢族與撒哈拉以南非洲人群中的分布差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）[4]；而其他兩個(gè)位點(diǎn)并未檢出不同。上述數(shù)據(jù)表明，位于人類DRD5基因5′-UTR區(qū)的位點(diǎn)rs2076907與位于編碼區(qū)的位點(diǎn)rs1800762的遺傳多態(tài)性存在種族或人種差異，對(duì)法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別中的種族鑒定具有一定意義。

[1]Marchese A，Beischlag TV，Nguyen T，et al.Two gene duplication events in the human and primate dopamine D5 receptor gene family[J].Gene，1995，154（2）：153-158.

[2]侯一平.法醫(yī)物證學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：15-23.

[3]Housley DJ， Nikolas M， Venta PJ，et al.SNP discovery and haplotype analysis in the segmentally duplicated DRD5 coding region[J].Ann Hum Genet，2009，73（Pt 3）：274-282.

[4]http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?locusId=1816.