高衛(wèi)民 ，曹志鵬 ，米 麗 ，杜中波 ，前田 均 ，朱寶利 ，

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110001；2.太倉市公安局，江蘇 太倉 215400；3.日本大阪市立大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)教室，大阪 545-8585日本）

心源性猝死是最常見的死因之一，也是法醫(yī)病理學(xué)鑒定的任務(wù)之一。傳統(tǒng)的法醫(yī)病理學(xué)對心肌損傷的認(rèn)定主要集中在形態(tài)學(xué)指標(biāo)的檢測。然而，一些心源性猝死的案件中引起猝死的病變或形態(tài)學(xué)指標(biāo)往往缺乏特異性，這類死亡可能與心功能障礙直接相關(guān)，例如一些心肌病、心律失常以及一些沒有明顯缺血性損傷的缺血性心肌病。因此，客觀評價死亡之前的心功能狀態(tài)能更好地闡明猝死的確切機(jī)制，尤其在缺乏典型形態(tài)學(xué)損傷的心源性猝死的案件中具有重要的法醫(yī)學(xué)意義[1-2]。

研究[3]表明，死后心包液中腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）與氮末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）濃度的比值與死前心功能狀態(tài)有很好的相關(guān)性，BNP濃度越高，死前的心功能障礙越嚴(yán)重，因此心包液中的BNP濃度能客觀反映死前心功能障礙的程度。然而心包液中BNP濃度的升高主要出現(xiàn)在慢性充血性心衰以及部分心肌梗死的案例中，而在一些由急性缺血性心肌病引起的猝死案例中，心包液中BNP則通常很低。由于BNP首先在心肌組織中合成，而后才到達(dá)心血和心包液。因此，本實驗以大鼠心肌組織作為研究對象，研究大鼠急性心功能障礙時心肌組織中BNP表達(dá)的變化規(guī)律，探討心肌組織中BNP表達(dá)在急性心功能障礙的法醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

兔抗大鼠BNP多克隆抗體（AB1549，美國Millipore 公 司 ），ElivisionTMsuperHRP （Mouse/Rabbit）IHC試劑盒（KIT-9921，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），預(yù)染蛋白marker（SM0671，立陶宛Ferments公司），大鼠BNP特異性ELISA試劑盒（美國 R&D 公司），D9108A RNAiso Plus、DRR037S逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DRR081S SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time，日本 TaKaRa Biotechnology公司），ECL發(fā)光劑（SC-2048，美國Santa Cruz Biotechnology公司），PRISM?7500 Real-Time PCR System （美國AB公司）等。

1.2 實驗動物

中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量 300～350 g，手術(shù)前飼養(yǎng)1周，每天換墊料，飼養(yǎng)室保證空氣流通，維持正常的光照時間和黑暗時間。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制作

參照文獻(xiàn)[4]制作急性心功能障礙動物模型：術(shù)前以40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，氣管插管，將心電圖電極固定在大鼠肢體上，實驗過程中全程監(jiān)測心電圖。胸骨右側(cè)第2肋間切口，分層打開胸腔，在主動脈根部鈍性游離主動脈，將內(nèi)徑為0.8mm的注射器針頭平行置于主動脈上，用4號手術(shù)絲線將主動脈和針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將針頭撤出，關(guān)胸，分層縫合，青霉素抗感染，大鼠恢復(fù)自主呼吸后，拔出氣管插管。 術(shù)后 1、2、4、6、8、10、12h 各取 5 只大鼠分別檢測血流動力學(xué)指標(biāo)，然后將大鼠斷頸處死，取心血以及左室前壁心肌組織，心肌組織分為3部分，分別作免疫組織化學(xué)、Western印跡法、實時RT-PCR分析。另取5只大鼠作為對照組，僅麻醉、氣管切開處理，不作開胸解剖。

模型成立后觀察血流動力學(xué)參數(shù)，包括左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室內(nèi)壓最大上升速率+dp/dtmax、左室內(nèi)壓最大下降速率-dp/dtmax。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色

左室前壁心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作厚度為5μm切片。BNP多克隆抗體以1∶600稀釋，采用Elivision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，具體步驟按照試劑盒使用說明書進(jìn)行，染色過程中另以抗體稀釋液代替一抗，作為陰性對照。

1.3.3 Western印跡法檢測

左室前壁心肌組織100 mg，加入組織-細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，超聲破碎，4℃下以離心半徑9.35 cm，12 000 r/min，離心40 min。取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印法100 mA 90min 轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，一抗（1∶600）、二抗（1∶2000）孵育后，加入ECL發(fā)光劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。凝膠成像系統(tǒng)對PVDF膜進(jìn)行成像，用Scion Image圖像分析軟件對所成像中蛋白條帶光密度進(jìn)行半定量分析。各組均以GAPDH為內(nèi)參照。

1.3.4 實時RT-PCR檢測

Trizol法提取心肌組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行合成，引物序列見表1。各組以GAPDH作為內(nèi)參，實時RT-PCR結(jié)果由PRISM?7500 Real-Time PCR System自動采集計算出BNP基因的相對含量，以相對含量的變化來反映BNP mRNA的變化。

表1 實時RT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，運(yùn)用Oneway ANOVA進(jìn)行組間分析，數(shù)據(jù)由±s表示。檢驗水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學(xué)參數(shù)

在實驗過程中，1h組有3只大鼠、2～12h組各有2只大鼠死亡。

血流動力學(xué)參數(shù)見表2，就大鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值（HW/BW）而言，除2h、10h組外，所有的實驗組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，實驗組大鼠的 LVSP、LVEDP、+dp/dtmax明顯升高，-dp/dtmax4～12 h明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表2），表明該模型造成了心室射血分?jǐn)?shù)減少，成功導(dǎo)致了大鼠急性心功能障礙。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（圖1）

對照組大鼠多呈陰性染色。隨著心功能障礙持續(xù)時間增加，實驗組大鼠陽性著色不斷增強(qiáng)：1～2h主要表現(xiàn)為弱陽性，部分心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見棕黃色顆粒狀沉積物，周圍的心肌細(xì)胞則呈陰性著色；4～6h心肌細(xì)胞主要表現(xiàn)為陽性，陽性細(xì)胞面積不斷增大，偶可見陰性著色細(xì)胞；10～12h大鼠心肌細(xì)胞表現(xiàn)為強(qiáng)陽性，陰性細(xì)胞幾乎不可見。另外，對同一張切片而言，心內(nèi)膜側(cè)的染色強(qiáng)度往往比心外膜側(cè)強(qiáng)，從心內(nèi)膜向心外膜染色強(qiáng)度逐漸減弱。

表2 血流動力學(xué)參數(shù) （±s）

表2 血流動力學(xué)參數(shù) （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05

組別 n HW/BW/（mg/g） HR/（次/min） LVSP/mmHg LVEDP/mmHg +dp/dtmax/（mmHg/s） -dp/dtmax/（mmHg/s）對照 5 3.15±0.17 380±36 91.3±6.8 2.3±0.3 4327±172 4210±320 1h 2 3.82±0.53 470±54 152.7±7.21） 13.2±3.21） 6801±2471） 3817±282 2h 3 4.36±0.251） 376±23 170.4±7.81） 20.3±2.71） 7217±2611） 3904±274 4h 3 3.57±0.36 341±25 178.2±6.91） 23.2±2.51） 7632±2481） 3682±2411）6h 3 3.72±0.48 325±32 182.1±9.31） 25.8±3.71） 6482±2651） 2896±2631）8h 3 3.75±0.83 330±27 186.6±10.21） 28.9±3.41） 6570±2861） 2763±1831）10h 3 4.47±0.971） 305±20 175.3±8.71） 20.2±2.41） 4872±1621） 2409±1671）12h 3 3.85±0.74 360±38 169.7±7.51） 18.5±1.91） 4620±1571） 2382±1461）

圖1 BNP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 Elivision×400

2.3 Western印跡法和實時RT-PCR結(jié)果

Western印跡法結(jié)果顯示，隨心功能障礙時間的持續(xù)，平均光密度呈升高趨勢，最大比值出現(xiàn)在10h，12h 開始下降（圖 2，表 3）。

實時RT-PCR結(jié)果顯示，BNP mRNA較BNP蛋白變化時間提前。急性心功能障礙后1h，大鼠心肌組織中BNP mRNA含量即達(dá)到對照組的3.4倍左右，而且BNP mRNA含量在6 h達(dá)到峰值，比BNP蛋白達(dá)到峰值的時間提前4h。6h后BNP mRNA含量呈下降趨勢（表3）。

圖2 Western印跡法結(jié)果

表3 大鼠急性心功能障礙后各時間段BNP蛋白平均光密度和BNP mRNA相對表達(dá)量（±s）

表3 大鼠急性心功能障礙后各時間段BNP蛋白平均光密度和BNP mRNA相對表達(dá)量（±s）

注：1）與對照組相比，P＜0.05；2）與相鄰上組相比，P＜0.05

組別 n 平均光密度 mRNA相對表達(dá)量對照 5 3.17±0.62 1 1h 2 21.60±1.241） 3.42±0.231）2h 3 42.38±1.721）2） 3.86±0.391）4h 3 55.04±2.191） 5.56±0.271）2）6h 3 61.70±2.981） 6.19±0.491）8h 3 83.92±3.281） 5.82±0.511）10h 3 95.71±2.761） 5.64±0.821）12h 3 75.30±2.971） 4.72±0.501）2）

2.4 心律失常致死大鼠心肌中BNP的表達(dá)

實驗過程中心電圖監(jiān)測結(jié)果顯示，心律失常是實驗過程中大鼠死亡的主要原因，尤以室性心律失常為主。對這類死亡大鼠心肌組織中BNP的研究發(fā)現(xiàn)，除BNP mRNA較對照組明顯升高外，免疫組化染色結(jié)果和Western印跡法結(jié)果與對照組相比均沒有明顯差異。

3 討 論

BNP是心室容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷增大時心肌細(xì)胞釋放的一種激素，機(jī)械性牽張是心肌細(xì)胞合成和分泌BNP的主要機(jī)制[6]。臨床研究[7]表明，血漿中BNP濃度與心室射血分?jǐn)?shù)具有相關(guān)性，心室射血分?jǐn)?shù)不足時，有效循環(huán)血量不足，大量的血液聚集在心室內(nèi)，導(dǎo)致心室壓力增大心室腔擴(kuò)張，從而引起B(yǎng)NP合成和釋放。因此，BNP是心臟容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷增大的直接產(chǎn)物，任何因素導(dǎo)致心功能障礙、射血分?jǐn)?shù)低下，都會導(dǎo)致BNP合成和釋放增加，死后檢測BNP極有可能反映死亡之前的心功能狀態(tài)。特別對于沒有明顯心肌缺血或者梗死的案例，死后檢測BNP能較客觀地反映死前的心功能障礙存在，在法醫(yī)學(xué)上有重要的意義[8]。本實驗表明大鼠主動脈縮窄后，血流動力學(xué)指標(biāo)包括LVSP、LVEDP、+dp/dtmax都明顯升高，表明心臟射血分?jǐn)?shù)明顯減小，心功能障礙模型建立。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，實驗組大鼠隨著心功能障礙持續(xù)時間的延長，染色強(qiáng)度從心內(nèi)膜向心外膜逐漸減弱，對照組染色結(jié)果為陰性。2h內(nèi)的染色以弱陽性為主，6h以后逐漸增強(qiáng)，呈陽性和強(qiáng)陽性，進(jìn)一步證實了BNP是反映心臟血流動力學(xué)負(fù)荷增大時的應(yīng)急和敏感指標(biāo)[9]，可見心功能障礙可以通過BNP的免疫組織化學(xué)染色顯示出來，染色強(qiáng)度能反映心功能障礙的持續(xù)時間。BNP蛋白定量檢測結(jié)果顯示，心肌組織中BNP濃度與心功能障礙持續(xù)時間有良好的相關(guān)性。

為探索早期BNP基因的表達(dá)，本研究同時也檢測了BNP mRNA的含量變化。結(jié)果表明急性心功能障礙后1h即能檢測到BNP mRNA顯著升高。關(guān)于大鼠急性心肌梗死模型中心肌組織BNP的表達(dá)規(guī)律早有報道。徐永城等[10]的研究表明，結(jié)扎左冠狀動脈前降支3h后，心肌組織中BNP mRNA才開始升高；Hama等[11]發(fā)現(xiàn)，阻斷心肌血流4 h后，左心室心肌中BNP mRNA的濃度明顯高于對照組。與先前的研究結(jié)果不同，本研究大鼠急性心功能障礙模型中，手術(shù)后1 h即能檢測到明顯的BNP mRNA升高，比上述實驗結(jié)果時間要早。另外，心功能處于代償期的時候，并不會引起B(yǎng)NP基因表達(dá)的上調(diào)，只有處于失代償性心功能障礙時BNP基因的表達(dá)才會增加，表明BNP是心功能從代償期到失代償期過渡的標(biāo)志物[12]，所以完全可以解釋為何心肌梗死3～4 h后才能檢測到BNP mRNA明顯升高這一結(jié)果?？紤]到正常心肌組織中基本沒有或者只含有少量的BNP蛋白和mRNA，只有心肌細(xì)胞存在機(jī)械性牽拉時才會刺激BNP的合成和分泌，故BNP mRNA是急性心功能障礙時心室容量負(fù)荷和壓力負(fù)荷增大，心室壁牽張信息的儲存體，尤其當(dāng)瀕死期很短時，BNP蛋白尚未合成和分泌，此時BNP mRNA的檢測將有助于解釋死亡時的微觀病理生理過程[13]。

研究心功能障礙時BNP的表達(dá)規(guī)律對一些由缺血性心臟病導(dǎo)致心源性猝死的認(rèn)定有一定的意義。在這些猝死的案件中，系統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)解剖往往檢測不到急性心肌梗死或者明顯的冠狀動脈狹窄或者冠狀動脈血栓形成，其中有一些冠狀動脈病變很輕微，冠狀動脈狹窄不超過Ⅱ級；而且在一些高度懷疑為缺血性心臟病致死的案件中，即使使用實時RT-PCR檢測技術(shù)都找不到明顯的缺血性損傷的證據(jù)[14]。就急性心肌缺血而言，筆者認(rèn)為，單純依據(jù)尸檢時檢測到輕微或局部的缺血性改變不足以準(zhǔn)確闡明猝死的確切機(jī)制和病理生理過程；急性心肌缺血往往只有引起急性心律失?；蛘邍?yán)重影響心室射血功能時才可能導(dǎo)致猝死，因此，在得出缺血性心臟病導(dǎo)致猝死的鑒定結(jié)論之前有必要客觀評價死亡之前的心功能狀態(tài)，結(jié)合本研究結(jié)果可以推測檢測心肌組織中BNP的表達(dá)情況對此類案件的診斷具有一定的參考價值。

另外，臨床研究[15-16]表明，心律失常，尤其是室性心律失常（ventricular arrhythmias，VA）是心源性猝死的主要致死原因。本實驗心電圖檢測結(jié)果表明，心功能障礙時常伴有各種心律失常發(fā)生，主要表現(xiàn)為室性心動過速和室顫，且心律失常死亡大鼠BNP mRNA明顯升高。心律失常發(fā)生時往往導(dǎo)致心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）降低，有效循環(huán)血量不足，心室過度充盈擴(kuò)張，必然導(dǎo)致心肌細(xì)胞合成和釋放BNP增加。很多研究[17-20]均表明BNP是預(yù)測住院病人發(fā)生心律失常及預(yù)后和死亡率的強(qiáng)有力的指標(biāo)，可見心肌組織中BNP與心律失常可能有密切的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，增加左心室后負(fù)荷造成急性心功能障礙后大鼠心肌組織中BNP、BNP mRNA的表達(dá)明顯升高，且具有一定的時間規(guī)律性。檢測心肌組織中BNP蛋白及BNP mRNA的表達(dá)可為法醫(yī)病理學(xué)者客觀評價心功能狀態(tài)提供一種新的途徑。

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