李忠杰 ，丁 梅 ，龐 灝 ，孫雪菲 ，邢佳鑫 ，宣金鋒 ，王保捷

（1.中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110001；2.張家港市公安局，江蘇 張家港 215600）

谷氨酸（Glu）為哺乳動物體內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)系統(tǒng)多種重要功能的調(diào)節(jié)，谷氨酸對于學習、記憶及神經(jīng)傳導等有著重要的作用，其傳導通路發(fā)生異常時，可能會引發(fā)精神疾病[1]。精神分裂癥（schizophrenia，SP）為一組病因不明的疾病，臨床表現(xiàn)以思維過程松散、不合邏輯的聯(lián)想、荒謬的妄想、情感不恰當或平淡和社會功能缺損為主要癥狀[2]。精神分裂癥是法醫(yī)學鑒定的重要內(nèi)容之一，除一定的環(huán)境因素影響外，其發(fā)病的遺傳學因素也得到了明確的證實，許多神經(jīng)遞質(zhì)與精神分裂癥的關(guān)系已有報道，可能為精神分裂癥的診斷或法醫(yī)學鑒定提供客觀的參考指標。

鑒于已知的GRIN1基因（谷氨酸受體基因之一）啟動子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點在中國人群中數(shù)據(jù)較少，國際上已有GRIN1基因SNP位點與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究[3-4]，本研究應(yīng)用PCR限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)結(jié)合PAGE法，分析中國北方漢族健康無關(guān)個體與精神分裂癥患者GRIN1基因5′端-855 G/C和-1140 G/A兩個SNP位點的遺傳多態(tài)性，并探討其與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)性，為法醫(yī)學鑒定提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

對照組：183例中國北方漢族健康無關(guān)個體血液樣本（男性86例，女性97例），由中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院血清學教研室提供（問卷調(diào)查三代內(nèi)無精神疾病）。

實驗組：172例偏執(zhí)型精神分裂癥患者血液樣本（男性80例，女性92例）收集自遼寧省第三人民醫(yī)院。精神分裂癥診斷標準同時符合美國精神病學會《精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊（第 4版）》（DSM-Ⅳ）和《中國精神障礙分類與診斷標準（第3版）》（CCMD-3）。血液樣本采集遵循知情同意原則。

1.2 方法

常規(guī)酚-氯仿法抽提DNA。擴增引物由TaKaRa公司合成，正向引物：5′-GGGGCGTTTGCTGTTAGGTC-3′；反向引物：5′-CGGAACATCTGCTCGTGCTT-3′。PCR 反應(yīng)總體系為 20 μL，包括模板 5～10 ng，2×GC緩沖液Ⅰ（Mg2+Plus） 10 μL，dNTP 16 nmol，正反向引物各4pmol。rTaq聚合酶（TaKaRa公司）1U。擴增條件：94℃ 1min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)30次；72℃ 2min，4℃保溫。

限制性內(nèi)切酶處理與分型：（1）-855 G/C酶切體系為 20μL，含 2μL 10×NEB 緩沖液 2，1U 限制性內(nèi)切酶BseRⅠ，2μL PCR產(chǎn)物，充分混勻后37℃反應(yīng)2h。反應(yīng)產(chǎn)物用T=6%、C=3.3%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯帶。（2）-1140 G/A 酶切體系為 20μL，含2 μL 10×NEB 緩沖液 2，1 U 限制性內(nèi)切酶 BsaJⅠ，2μL PCR產(chǎn)物，充分混勻后60℃反應(yīng)2h。反應(yīng)產(chǎn)物用T=6%、C=5%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯帶[5]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用直接計數(shù)法計算基因型頻率和等位基因頻率，進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。對照組和實驗組間基因型和等位基因頻率分布的差異用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 -855 G/C與-1140 G/A位點的遺傳多態(tài)性分布

在-855 G/C位點中，檢出3種基因型：GG、GC、CC；在-1140 G/A位點中，檢出2種基因型：GG、GA。經(jīng)χ2檢驗，所調(diào)查的數(shù)據(jù)基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P＞0.05）。

2.2 -855 G/C、-1140 G/A位點遺傳多態(tài)性在兩組中的分布及比較

-855 G/C、-1140 G/A位點遺傳多態(tài)性在兩組中的分布及比較見表1～2。-855 G/C位點遺傳多態(tài)性分布在組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；-1140 G/A位點遺傳多態(tài)性分布在組間差異具有統(tǒng)計學意義，實驗組基因型GG的頻率低于對照組7.11%，實驗組等位基因A的頻率高于對照組3.56%（P＜0.05）。

按性別分類比較，-855 G/C位點基因型分布在女性組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組基因型GG的頻率高于對照組14.18%，實驗組等位基因G的頻率高于對照組6.55%。-1140 G/A位點遺傳多態(tài)性分布在女性組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），實驗組基因型GG的頻率低于對照組8.70%，實驗組等位基因A的頻率高于對照組4.35%。然而，-855 G/C位點和-1140 G/A位點基因型分布在男性組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 -855 G/C位點遺傳多態(tài)性在對照組與實驗組中的分布 ［n（%）］

表2 -1140 G/A位點遺傳多態(tài)性在對照組與實驗組中的分布 ［n（%）］

3 討 論

人類GRIN1基因位于9q34.3，共有22個外顯子，全長約31kb，其基因表達產(chǎn)物調(diào)控早期大腦發(fā)育突觸的形成、維持等。谷氨酸系統(tǒng)活動異常能影響神經(jīng)元的可塑性和引起神經(jīng)毒性[1]。一般來講，基因的啟動子區(qū)域（5′端非翻譯區(qū)）是調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯的重要靶點，其內(nèi)部序列的變異可能影響基因表達產(chǎn)物功能蛋白量的變化。本研究的-855 G/C、-1140 G/A兩個SNP位點位于該基因的5′端非翻譯區(qū)。結(jié)果顯示，-855 G/C位點在女性組間基因型分布差異具有統(tǒng)計學意義；-1140 G/A位點在組間以及女性組間的基因型和等位基因頻率分布差異都具有統(tǒng)計學意義。推測可能是相應(yīng)的堿基替換影響了轉(zhuǎn)錄，進而編碼受體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，也可能引起谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生量的變化，具體機制有待深入研究。

Hung等[4]利用PCR-SSCP和RFLP的方法研究了GRIN1啟動子區(qū)域的-855 G/C和-1140 G/A，結(jié)果這兩個SNP位點沒有顯示出與精神分裂癥的遺傳關(guān)聯(lián)性。Begni等[6]對意大利人群的研究證實GRIN1基因上-855 G/C多態(tài)性與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)，提出GRIN1可能是精神分裂癥敏感的候選基因之一。Zhao等[7]檢測了中國漢族群體5個GRIN1基因的SNP，發(fā)現(xiàn)位于5′非翻譯區(qū)-855 G/C位點的C等位基因在實驗組中高頻表達，提示-855 G/C是精神分裂癥候選SNP位點。Galehdari等[8]采用PCR-RFLP法研究了GRIN1基因啟動子區(qū)-855 G/C在伊朗人群中的多態(tài)性分布，通過病例對照研究揭示該位點多態(tài)性分布與精神分裂癥很強的相關(guān)性，進而提出，C等位基因與精神分裂癥發(fā)病風險的增加有關(guān)。研究[9]提示，不同的結(jié)果可能是人群的遺傳異質(zhì)性造成。

在本研究中，按性別分類統(tǒng)計比較后，-855 G/C位點基因型分布在女性組間的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），推測-855 G/C位點單堿基突變可能在精神分裂癥的發(fā)生中起到一定的調(diào)控作用。GRIN1基因啟動子區(qū)域的-1140 G/A位點基因突變可能與精神分裂癥發(fā)生的遺傳病因?qū)W有關(guān)，同時，精神分裂癥發(fā)生的遺傳學因素可能存在性別傾向。人類精神疾病的發(fā)生有環(huán)境因素與遺傳學傾向，多基因座的綜合分析研究應(yīng)是揭示精神疾病發(fā)病原因的有效途徑。

[1]李忠杰，王保捷，丁梅，等.谷氨酸受體基因單核苷酸多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)[J].法醫(yī)學雜志，2008，24（5）：369-374，377.

[2]趙靖平.精神分裂癥[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：9.

[3]VanDongen AM，VanDongen HM.Effects of mRNA untranslated regions on translational efficiency of NMDA receptor subunits[J].Neurosignals，2004，13（4）：194-206.

[4]Hung CC，Chen HY，Chen CH.Systematic mutation analysis of the human glutamate receptor，ionotropic，N-methyl-D-aspartate 1 gene （GRIN1） in schizophrenic patients[J].Psychiatr Genet，2002，12（4）：225-230.

[5]李忠杰，王保捷，丁梅，等.GRIN1基因-855 G/C和-1140 G/A 位點遺傳多態(tài)性[J].法醫(yī)學雜志，2009，25（3）：217-218.

[6]Begni S，Moraschi S，Bignotti S，et al.Association between the G1001C polymorphism in the GRIN1 gene promoter region and schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2003，53（7）：617-619.

[7]Zhao X，Li H，Shi Y，et al.Significant association between the genetic variations in the 5′end of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit gene GRIN1 and schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2006，59（8）：747-753.

[8]Galehdari H，Pooryasin A，F(xiàn)oroughmand A，et al.Association between the G1001C polymorphism in the GRIN1 gene promoter and schizophrenia in the Iranian population[J].J Mol Neurosci，2009，38（2）：178-181.

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