麻少瑩，李媛媛，郭海蓉，*，李志春

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004；2.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，河南鄭州450004；3.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧530007）

甘蔗糖蜜是甘蔗制糖時的副產(chǎn)品，其具有干物質(zhì)濃度極大、糖分含量高等特點。因糖蜜本身含有大量的可發(fā)酵性糖，因此適合用作發(fā)酵原料[1-4]。這為甘蔗糖蜜的綜合利用提供了新途徑，也可有效實現(xiàn)甘蔗糖蜜的高附加值的資源化利用。VB12是一種重要的生物活性物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和畜牧業(yè)，是許多微生物和動物的生長因子。VB2是一種重要的水溶性B族維生素，參與機體生物氧化過程，是人類和動物不可或缺的營養(yǎng)補充劑，主要用于作為醫(yī)藥品、食品、飼料等的添加劑。隨著國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)旺盛，各種飼料的產(chǎn)量連年大幅上升，飼料添加劑對VB12與VB2的需求量很大。VB12與VB2生產(chǎn)時大多利用還原糖作為碳源，可結(jié)合糖蜜的資源化利用，將其作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)VB12與VB2。

混菌發(fā)酵是近年來飼料行業(yè)研究的熱點，混菌發(fā)酵在縮短發(fā)酵周期的同時，可獲得更多的功能性成分。謝氏丙酸桿菌是一種兼性厭氧細菌，可發(fā)酵生產(chǎn)VB12?？莶菅挎邨U菌是一種好氣性菌，自身生長代謝過程中可生產(chǎn)VB2[5]。單純采用謝氏丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)VB12，作為代謝產(chǎn)物的丙酸會對發(fā)酵過程產(chǎn)生抑制作用?？莶菅挎邨U菌在生長過程中可以利用丙酸，在促進自身生長的同時，可有效解除丙酸等有機酸對謝氏丙酸桿菌的抑制作用，此外，枯草芽孢桿菌進行有氧繁殖時可以消耗環(huán)境中的氧氣為謝氏丙酸桿菌提供厭氧環(huán)境，這些均有利于兩種菌互利共生發(fā)酵，進而有利于提高VB12與VB2的產(chǎn)量。

本文以謝氏丙酸桿菌和枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，甘蔗糖蜜為主要原料，對混菌發(fā)酵生產(chǎn)VB12與VB2的生產(chǎn)工藝進行了優(yōu)化，以提高其產(chǎn)量，為甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)功能性飼料添加劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

謝氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）GIMCC編號：GIM1.166，凍干管保藏，購于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 本實驗室保藏；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鋅等 國產(chǎn)分析純；瓊脂粉、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏 國產(chǎn)生化試劑；3，5-二硝基水楊酸、5，6-二甲基苯并咪唑 國產(chǎn)化學純；糖蜜 取自廣西東門南華糖業(yè)有限責任公司，取后即放入4℃冰箱冷藏備用。

FA2004型電子天平 上海精科天平公司；THZ-82 B型熒光光度計 上海精密科學儀器廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SP-752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；LRH-250-Z型全溫振蕩培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；pH211型pH計 HANNA Instruments。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 謝氏丙酸桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1.1 活化培養(yǎng)基（g/L）及培養(yǎng)條件 玉米漿5，葡萄糖2，六水合二氯化鈷0.0004，磷酸氫二鉀0.8，硫酸銨 0.2，pH6.8～7.0，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間72h。

1.2.1.2 斜面培養(yǎng)基（g/L）及培養(yǎng)條件 葡萄糖20，酵母膏10，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二銨4，氯化鈣0.0100，氯化鈉0.0100，六水合二氯化鈷0.0100，瓊脂粉20，pH6.8，靜止培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間48～52h。

1.2.1.3 液體種子培養(yǎng)基（g/L）及培養(yǎng)條件 葡萄糖20，酵母膏10，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二銨4，氯化鈣0.0100，氯化鈉0.0100，六水合二氯化鈷0.0100，pH6.8～7.2；培養(yǎng)條件：在裝液量為20mL/100mL三角瓶中接一環(huán)斜面菌種，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)48h。

1.2.2 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 a.斜面培養(yǎng)基（g/L）及培養(yǎng)條件 葡萄糖20，牛肉膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂粉20，pH7.0，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間24～40h。b.液體種子培養(yǎng)基（g/L）及培養(yǎng)條件蔗糖25，牛肉膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，pH 7.0，培養(yǎng)條件：在裝液量為30/100mL三角瓶中接一環(huán)斜面菌種，于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h。c.混菌發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 糖蜜100（即糖蜜濃度為20%v/v），酵母膏100，磷酸二氫鉀2，磷酸氫二銨4，氯化鈣0.0100，氯化鈉0.0100，六水合二氯化鈷0.0700，5，6-二甲基苯并咪唑0.07。

1.3 實驗方法

1.3.1 維生素B12測定方法

1.3.1.1 菌體中VB12含量的測定 參考GB9841-88，稱取一定量的經(jīng)過濾處理后的濕菌體，以20%（W/V）比例加入去離子水使其充分溶解，超聲破碎處理菌懸液，4000r/min離心15min，吸取一定量的經(jīng)離心過濾后的細胞破碎液置于干凈的試管中，用去離子水進行適當倍數(shù)的稀釋，以去離子水作為參比液，在361nm波長處測定VB12的吸光度，盡量使所測吸光值保持在0.2～0.8范圍內(nèi)[6-11]。

根據(jù)Lambert-Beer定律，在上述實驗條件下，計算每升發(fā)酵液中VB12（mg/L）的含量，計算公式如下：

其中，A361為361nm波長下VB12的吸光值，為發(fā)酵液離心后所得濕菌體（g）。

1.3.1.2 VB12標準曲線的制作 稱取VB12標準品0.0025g，用蒸餾水溶解并定容于25mL棕色容量瓶中，搖勻，配成濃度為100μg/mL的VB12標準儲備溶液。

量取VB12標準儲備液1mL，用水分別按1.5、2、4、6、8、10、15、20倍稀釋，搖勻。在361nm波長處測定稀釋液的吸光度。以吸光度為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 維生素B2的測定

1.3.2.1 發(fā)酵液VB2含量的測定 在1mL發(fā)酵液中加入9mL 0.05mol/L NaOH溶液，制備VB2檢測液，4700r/min離心10min，用乙酸鈉-乙酸緩沖液稀釋離心上清液，使吸光值在0.2～0.8之間。在444nm波長處以乙酸鈉-乙酸緩沖液為空白對照測定處理后發(fā)酵液樣品的OD值。按照下式計算VB2的含量[12-14]。

式中，OD為444nm波長下VB2的吸光值。

1.3.2.2 VB2標準曲線的制作 稱取VB2標準品0.0100g，先加入少量蒸餾水后加入1mL冰乙酸，再加入適量蒸餾水，將其放入100℃水浴鍋中保溫60min以上。待其完全溶解后拿出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至100mL棕色容量瓶中，搖勻后即配成濃度為100μg/mL的VB2標準溶液。

量取VB2標準溶液1mL，用乙酸鈉-乙酸緩沖液分別按1.5、2、4、6、8、10、15、20倍稀釋，搖勻。以吸光度為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 混菌發(fā)酵產(chǎn)VB12與VB2的單因素實驗設(shè)計 在糖蜜濃度20%（v/v）、發(fā)酵液初始pH7.0、裝液量100mL/300mL，接種量20%（v/v，單菌的接種量為1∶1[15]），于30℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)80h的條件下，分別考察培養(yǎng)時間：0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96h；糖蜜濃度5%、10%、15%、20%、25%（v/v）；培養(yǎng)溫度26、28、30、32、34、36、38、40℃；接種量5%、10%、15%、20%、25%（v/v，單菌的接種量為1∶1）；裝液量（總體積300mL）50、75、100、125、150mL；初始pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0對VB12與VB2產(chǎn)量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計及分析 采用Box-Behnken設(shè)計確定重要參數(shù)的最佳水平。綜合單因素實驗結(jié)果，實驗選取糖蜜濃度、裝液量及接種量3個主效因子作為響應(yīng)面實驗的因素。響應(yīng)面各因素及水平如表1所示。

表1 因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線繪制

2.1.1 VB12標準曲線 根據(jù)標準曲線（圖1）得到回歸方程為y=0.0173x-0.0442，r=0.9999。VB12溶液在5.00～100.00mg/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。

圖1 VB12標準曲線Fig.1 Calibration curve of VB12

2.1.2 VB2標準曲線 根據(jù)標準曲線（圖2）得到回歸方程為y=0.0279x+0.0586，r=0.9984。VB2溶液在5.00～100.00mg/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。

圖2 VB2標準曲線Fig.2 Calibration curve of VB2

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 培養(yǎng)時間對VB12與VB2產(chǎn)量的影響 由圖3可知，0～56h內(nèi)是VB12的迅速合成時期，56h后VB12的合成速度開始放緩；64～96h內(nèi)VB12的含量緩慢上升，96h時的含量為250.53mg/L。

圖3 發(fā)酵時間對VB12與VB2產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on vitamin B12and vitamin B2production

發(fā)酵液中VB2的含量在0～40h之間沒有太大變化，說明枯草芽孢桿菌在混菌發(fā)酵過程中的延遲期較單獨培養(yǎng)時長，可能是發(fā)酵初期謝氏丙酸桿菌充分利用碳源發(fā)酵生長，抑制了枯草芽孢桿菌的生長。但在發(fā)酵時間超過40h后，VB2的產(chǎn)量顯著上升，72h時達到最大值，為9.39g/L。兩者的總產(chǎn)量在72h時最大，由此可初步確定混菌的最適培養(yǎng)時間為72h。

實驗結(jié)果表明好氧性的枯草芽孢桿菌和兼性厭氧的謝氏丙酸桿菌能很好地共生發(fā)酵，在發(fā)酵64～80h內(nèi)均能獲得較多的發(fā)酵產(chǎn)物，其最大產(chǎn)物量獲得時間均比單菌發(fā)酵時最大產(chǎn)物量獲得時間短。謝氏丙酸桿菌和枯草芽孢桿菌能夠較好地共存發(fā)酵，可能是得益于它們之間的分解與合成代謝的一些相互促進作用。由于微生物的分解和合成代謝過程較為復(fù)雜，因此混菌互利代謝機理仍需進一步研究。

2.2.2 糖蜜濃度對VB12與VB2產(chǎn)量的影響 如圖4所示，在5%～15%（v/v）的糖蜜濃度范圍內(nèi)，VB12與VB2的產(chǎn)量都不斷上升，VB12的產(chǎn)量在濃度為20%（v/v）時達到最大值，為237mg/L，而VB2的產(chǎn)量在濃度為15%（v/v）時達到最大值，為9.24g/L，在最適濃度之后隨著糖蜜濃度的繼續(xù)增加兩者的產(chǎn)量均有所下降，但兩者的總產(chǎn)量在濃度為20%（v/v）時達到最高，是混菌發(fā)酵的最佳濃度。這是因為濃度為5%～10%（v/v）的糖蜜所能提供的碳源很有限，不能滿足混菌生長及生產(chǎn)VB12與VB2的需要，當濃度增加至25%（v/v）時，糖蜜中不利于菌體生長的有機、無機物質(zhì)也隨著濃度的升高而增加，反而抑制菌體的生長。

圖4 糖蜜濃度對VB12與VB2產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of molasses concentration on vitamin B12and vitamin B2production

2.2.3 溫度對VB12與VB2產(chǎn)量的影響 由圖5可知，在26～30℃的溫度范圍內(nèi)，VB12與VB2的產(chǎn)量隨著溫度的升高不斷增加，并在30℃時達到最大值，分別為240.64mg/L和7.99g/L，然后隨著溫度的繼續(xù)升高，總產(chǎn)量急劇降低。圖5表明，30℃的培養(yǎng)溫度是混菌共生發(fā)酵的最佳溫度。

圖5 溫度對VB12與VB2產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of temperature on vitamin B12and vitamin B2production

2.2.4 接種量對VB12與VB2產(chǎn)量的影響 由圖6可知，在5%～15%（v/v）的混菌接種量范圍內(nèi)，VB12與VB2的產(chǎn)量都隨著接種量的增大而增大，VB12的產(chǎn)量在接種量為20%（v/v）時達到最大值，為224mg/L，此時VB2的產(chǎn)量為7.15g/L，而VB2的產(chǎn)量在15%（v/v）時達到最大值，為9.17g/L，此時VB12的產(chǎn)量為196mg/L，在各自最適接種量之后隨著接種量的繼續(xù)增加，兩者的產(chǎn)量均有所降低。因VB12的市面價值與營養(yǎng)價值較VB2的高，所以在確定最佳水平時以VB12的產(chǎn)量大為主，因此選定混菌最適接種量為20%（v/v）。合適的接種量使得菌體縮短延遲期快速進入對數(shù)期，有利于縮短發(fā)酵周期和提高產(chǎn)物產(chǎn)量[16]。

圖6 接種量對VB12與VB2產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculum concentration on vitamin B12and vitamin B2production

2.2.5 裝液量對VB12與VB2產(chǎn)量的影響 由圖7可知，在50～100mL/300mL三角瓶的裝液量范圍內(nèi)，VB12與VB2的產(chǎn)量都隨著裝液量的增大而增大，兩者的產(chǎn)量均在裝液量為100mL時達到最大值，分別為238mg/L和8.59g/L，隨著裝液量的繼續(xù)增大，VB12與VB2的總產(chǎn)量不斷降低。因此確定混菌發(fā)酵的最佳裝液量為100mL/300mL三角瓶。

圖7 裝液量對VB12與VB2產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of fermentation medium volume on vitamin B12and vitamin B2production

2.2.6 發(fā)酵液初始pH對VB12與VB2產(chǎn)量的影響 由圖8可知，在6.0～7.0的pH范圍內(nèi)，VB12與VB2的產(chǎn)量都隨著pH不斷的升高而增大，VB12與VB2的產(chǎn)量在pH為7.0時均達到最大值，分別為220mg/L和8.62g/L，隨著pH的繼續(xù)增大，VB12與VB2的總產(chǎn)量急劇降低。結(jié)果表明偏酸或偏堿環(huán)境均不利于VB12與VB2的高產(chǎn)量合成。這是由于pH影響菌體細胞膜的帶電狀態(tài)，從而影響細胞膜的滲透性，進而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與代謝產(chǎn)物的排泄；此外pH還影響酶的活性，不同的酶有其最適合的pH，當菌體中的酶系處于不適合的pH環(huán)境時，必然影響到其代謝活動，對產(chǎn)物的合成也會造成較大影響[17]。由實驗結(jié)果可初步確定混菌發(fā)酵的最佳初始pH為7.0。

圖8 pH對VB12與VB2產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of pH on vitamin B12and vitamin B2production

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果及分析

由單因素實驗結(jié)果可知，糖蜜濃度、裝液量及接種量3個因子對VB12與VB2的產(chǎn)量影響最顯著，故選擇作為響應(yīng)面的實驗因素。根據(jù)表1采用Design-Expert數(shù)學軟件中的Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實驗，實驗方案及結(jié)果見表2。

對表2中數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程：

Y1=260.66+20.60X1+23.44X2-6.41X3+4.87X1X2-9.86X1X3+12.91X2X3-23.78X12-56.60X22-7.49X32。

混菌發(fā)酵產(chǎn)VB12的方差分析結(jié)果見表3。該模型p＜0.0001，顯著；誤差p=4.07，不顯著，說明響應(yīng)面回歸模型有高度顯著性。模型的決定系數(shù)=0.9858，說明有98.58%的數(shù)據(jù)可用此模型預(yù)測。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Design and result of response surface analysis

表3 VB12產(chǎn)量的回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis of vitamin B12

因素一次項X1、X2、X3，交互項X1X3、X2X3，及二次項X12、X22對混菌發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響顯著。由F值可知，裝液量較其他因素對VB12產(chǎn)量的影響最大，糖蜜濃度次之，接種量的影響最弱。因素的交互作用對VB12產(chǎn)量影響的順序為：裝液量與接種量＞糖蜜濃度與接種量＞糖蜜濃度與裝液量。

將回歸方程分別對X1、X2、X3進行求導(dǎo)，且分別令導(dǎo)數(shù)等于0，換算成實驗條件的最佳點為：糖蜜濃度20%（v/v），裝液量107.67mL，接種量17.48%（v/v），模型預(yù)測VB12的產(chǎn)量為262.676mg/L。

考慮到操作的簡便性，將產(chǎn)VB12的最優(yōu)發(fā)酵條件修正為：糖蜜濃度20%（v/v），裝液量100mL/300mL三角瓶，混菌接種量18%（v/v），發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72h，初始pH7.0，在此條件下VB12與VB2的產(chǎn)量分別為262.54mg/L和10.14g/L，與響應(yīng)面模型具有較好的擬合性，產(chǎn)量較單菌培養(yǎng)時的最高產(chǎn)量分別提高了13.16%和12.42%。

表4 VB2產(chǎn)量的回歸與方差分析結(jié)果Table 4 Results of regression and variance analysis of vitamin B2

對表2進行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程：

Y2=10.48+0.23X1+0.53X2+0.22X3-0.072X1X2-0.085X1X3-0.075X2X3-0.95X12-1.12X22-0.35X32。

混菌發(fā)酵產(chǎn)VB2的方差分析結(jié)果見表4。由表4可知：該模型p=0.0098，顯著；誤差項p=0.29，不顯著，說明響應(yīng)面回歸模型有較高的顯著性。決定系數(shù)為0.8968，說明89.68%的數(shù)據(jù)可用此模型解釋。

因素X2、X12、X22對混菌發(fā)酵產(chǎn)VB2的影響顯著。由F值可知，三因素對VB2產(chǎn)量的影響次序為：裝液量＞糖蜜濃度＞接種量。各因素的交互作用對VB2產(chǎn)量影響不顯著。

將回歸方程分別對X1、X2、X3進行求導(dǎo)，且分別令導(dǎo)數(shù)等于0，換算成實驗條件的最佳點為：糖蜜濃度18.83%（v/v），裝液量105.91mL，接種量16.14%（v/v），模型預(yù)測VB2的產(chǎn)量為10.94g/L。

考慮到操作的簡便性，將產(chǎn)VB2的最優(yōu)發(fā)酵條件修正為：糖蜜濃度19%（v/v），裝液量100mL/300mL三角瓶，混菌接種量16%（v/v），發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72h，初始pH7.0，在此條件下VB12與VB2的產(chǎn)量分別為251.78mg/L和10.86g/L，與響應(yīng)面模型具有較好的擬合性。

因VB12的市面價值與營養(yǎng)價值較VB2的高，所以在確定最佳發(fā)酵條件時以VB12的產(chǎn)量大為主，綜上所述，將混菌發(fā)酵產(chǎn)VB12與VB2的最優(yōu)發(fā)酵條件定為：糖蜜濃度20%（v/v），裝液量100mL/300mL三角瓶，混菌接種量18%（v/v），發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72h，初始pH7.0。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了謝氏丙酸桿菌和枯草芽孢桿菌混菌發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)VB12與VB2的體系。發(fā)酵生產(chǎn)VB12存在底物抑制現(xiàn)象，在發(fā)酵過程中接入枯草芽孢桿菌，與謝氏丙酸桿菌競爭消耗可發(fā)酵性糖，可降低底物對發(fā)酵生產(chǎn)VB12的抑制作用，提高VB12的產(chǎn)量?；炀l(fā)酵生產(chǎn)VB12與VB2的最佳條件為：糖蜜濃度20%（v/v），裝液量100mL/300mL三角瓶，混菌接種量18%（v/v，單菌接種量1∶1），發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72h，初始pH7.0，在此條件下VB12與VB2的產(chǎn)量分別為262.54mg/L和10.14g/L，與響應(yīng)面模型具有較好的擬合性，產(chǎn)量較單菌培養(yǎng)時的最高產(chǎn)量分別提高了13.16%和12.42%。

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