曾慶華，樊 琛，孫小凡，李 燕，劉桂芹，王 會(huì)

（聊城大學(xué)食品科學(xué)與工程系，山東聊城252059）

紅景天（Rhodiola sachalinensis A.Bor.）屬被子植物門(mén)薔薇目景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.），為多年生草本或亞灌木野生植物，其品種繁多，資源豐富，全世界共有90多種，我國(guó)約有73種，主要分布在四川、東北、新疆、甘肅、西藏、云南、貴州等地[1-3]。紅景天具有特殊的適應(yīng)性和很強(qiáng)的生命力，素有“高原人參”和“雪山仙草”之稱(chēng)[4-5]。紅景天全株可入藥，尤以其根莖及根為最佳。《神農(nóng)本草經(jīng)》將紅景天列為藥中上品，2005版第一部《中國(guó)藥典》也將紅景天收錄其中，這些都充分證明了紅景天養(yǎng)生保健的藥用價(jià)值[6]。

紅景天苷是紅景天的主要有效性成分，也是評(píng)價(jià)紅景天的最重要指標(biāo)[7-8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，紅景天苷具有消除疲勞、抗衰老、抗缺氧、抗微波輻射、抗腫瘤等作用；對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)起到調(diào)節(jié)作用；改善心血管系統(tǒng)、影響三大物質(zhì)的代謝。另外，紅景天苷還具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及適應(yīng)原樣等作用，被稱(chēng)為繼人參、刺五加之后的新一代極具發(fā)展?jié)摿Φ沫h(huán)境適應(yīng)藥物，在軍事醫(yī)學(xué)、航空醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)保健醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值[9-11]。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)紅景天的化學(xué)成分、藥理作用、主要有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定有較為深入的研究，但對(duì)于其提取純化工藝的研究，還處于初始階段[12]。因此，紅景天苷的提純工藝優(yōu)化研究意義重大。已有的科研報(bào)道中，對(duì)紅景天有效成分的粗提取大多采用溶劑提取法[13]（包括熱提取法和浸泡提取法）、微波輔助法[14]、超聲波提取法[15]、超臨界萃取法[16]等。溶劑提取法耗時(shí)較長(zhǎng)。超臨界萃取法所得產(chǎn)品質(zhì)量高，但設(shè)備一次性投入較大。微波輔助法與超聲波提取法在紅景天苷提取中的應(yīng)用一般作為單一技術(shù)使用。周明等[17]利用超聲波-微波協(xié)同提取靈芝多糖，結(jié)果超聲波-微波協(xié)同萃取法與常規(guī)熱水提取工藝相比，可減少3/4的提取時(shí)間，提高26.27%的提取效率。利用超聲波-微波協(xié)同提取紅景天苷的工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面法對(duì)超聲波-微波協(xié)同提取紅景天苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為超聲波-微波協(xié)同提取紅景天苷產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅景天 產(chǎn)地云南，購(gòu)于聊城市利民中藥飲片有限公司，粉碎后過(guò)40目篩備用；紅景天苷對(duì)照品 貴州迪達(dá)科技有限責(zé)任公司；蒸餾水、95%乙醇、10%醋酸鉛溶液、正丁醇、飽和硫酸鈉溶液 均為分析純。

KQ3200型超聲波清洗器 超聲功率150W，昆山市超聲儀器有限公司；常壓微波合成/萃取工作站 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；TG-16WS型臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 精密稱(chēng)取紅景天苷對(duì)照品20.1mg，置于100mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，并搖勻，即得濃度為0.20g/L的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0mL置10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，并搖勻，在200～400nm波長(zhǎng)下掃描[18]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取1.2.1所得紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0﹑2.0﹑3.0﹑4.0﹑5.0﹑6.0mL，放于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻，在276nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 紅景天中紅景天苷的提取方法

1.2.3.1 紅景天苷提取工藝流程 紅景天根→粉碎（過(guò)40目篩）→超聲波處理→微波提取→抽濾→濾液定容→除雜→離心→定容→測(cè)定吸光度。

1.2.3.2 紅景天苷的提取方法 將干燥的紅景天根置于中藥粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)40目篩備用。準(zhǔn)確稱(chēng)取紅景天粉末5.0000g，置于100mL微波儀專(zhuān)用三頸燒瓶中，加入一定比例的乙醇溶液，在一定條件下超聲一定時(shí)間，然后在實(shí)驗(yàn)條件下微波輔助提取一定時(shí)間，抽濾得濾液，濾液定容于100mL容量瓶中，搖勻，量取10mL濾液于燒杯中，加入2mL 10%醋酸鉛溶液，搖勻充分反應(yīng)后再加入0.5mL飽和硫酸鈉溶液，搖勻脫鉛。將反應(yīng)液以4000r/min離心15min，取上清液用蒸餾水定容于50mL容量瓶，搖勻。以蒸餾水作參比液，于276nm測(cè)定吸光度。

1.2.3.3 紅景天苷得率測(cè)定 按照1.2.3.2中的方法做實(shí)驗(yàn)，獲得吸光度值，將此值代入回歸方程y=4.6676x-0.006，得出提取液中有效成分的濃度a（mg/mL）。將此濃度代入公式：紅景天苷的得率（%）=（a×500/b）×100；式中，b代表樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 超聲波-微波協(xié)同提取紅景天中紅景天苷的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化主要包括乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲波時(shí)間、微波時(shí)間、微波功率的選擇。針對(duì)這幾個(gè)因素分別按照1.2.3.2中的方法做單因素實(shí)驗(yàn)，考察它們對(duì)得率的影響，選擇最佳的提取條件。

1.2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 固定料液比1∶20，超聲波時(shí)間20min，微波時(shí)間10min，微波功率400W，在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%的條件下提取。

1.2.4.2 料液比的選擇 固定乙醇濃度70%，超聲波時(shí)間20min，微波時(shí)間10min，微波功率400W，分別在料液比為1∶10﹑1∶15﹑1∶20﹑1∶25﹑1∶30的條件下提取。

1.2.4.3 超聲時(shí)間選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，微波時(shí)間10min，微波功率400W，分別在超聲波時(shí)間為10﹑20﹑30﹑40﹑50min的條件下提取。

1.2.4.4 微波時(shí)間選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲波時(shí)間20min，料液比1∶20，微波功率400W，分別在微波時(shí)間為6、8、10、12、14min的條件下提取。

1.2.4.5 微波功率選擇 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，超聲波時(shí)間20min，微波時(shí)間10min，分別在微波功率為300、400、500、600、700W的條件下提取。1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間作為自變量進(jìn)行3因素3水平中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)紅景天苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。水平因素設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)確定

吸收光譜如圖1所示，紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在221nm和276nm處具有最大吸收峰，但供試品溶液在221nm附近存在干擾性雜質(zhì)[19]，對(duì)吸光度的穩(wěn)定性有影響，因此，本文選擇以276nm作為紅景天苷有效成分的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，吸光度（Y）與紅景天苷濃度（x，mg/mL）的線性回歸方程為：Y=4.6676x-0.006，R2=0.9997，其中，Y與x在0～0.12mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

圖1 紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of the standard salidroside solution

圖2 紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of the standard salidroside solution

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅景天苷得率的影響 由圖3可知，紅景天苷得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而有所提高，但超過(guò)70%以后有所下降。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)70%作為最佳提取濃度。濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于有效成分的提取，這是因?yàn)闈舛容^大時(shí)，過(guò)高的滲透壓使溶劑不易滲入紅景天組織細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，而濃度過(guò)低又不利于有效成分的溶解和吸收所導(dǎo)致的。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅景天苷得率的影響Fig.3 Effect of volume fraction of ethanol on the yield of salidroside

2.3.2 料液比對(duì)紅景天苷得率的影響 由圖4可知，在料液比為1∶10～1∶20的區(qū)間內(nèi)，隨著溶媒量的增加，紅景天苷得率逐漸增大，因?yàn)樵诖艘毫媳确秶鷥?nèi)，浸提用的溶劑量還不足以溶解浸出的紅景天苷，提取液已達(dá)到飽和；但在料液比1∶20以后增加不明顯，另一方面，溶媒量增加，生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度也會(huì)增大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益和抽濾時(shí)間，因此選用1∶20的料液比作為最佳料液比。

圖4 料液比對(duì)紅景天苷得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of salidroside

2.3.3 超聲波時(shí)間對(duì)紅景天苷得率的影響 由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的增加，紅景天苷得率不斷增加，但超過(guò)30min后不斷減小，考慮到提取時(shí)間和經(jīng)濟(jì)效益，因此選擇20min作為最佳超聲波提取時(shí)間。分析原因?yàn)椋涸谝欢〞r(shí)間范圍內(nèi)，隨超聲波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中的含水量增加，加快了固相中紅景天苷向水中的溶解，使紅景天苷的浸出更充分；而超聲波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致紅景天苷水解進(jìn)程的加快，從而使提取率有所下降。

圖5 超聲波時(shí)間對(duì)紅景天苷得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic wave extraction time on the yield of salidroside

2.3.4 微波時(shí)間對(duì)紅景天苷得率的影響 由圖6可知，隨著微波時(shí)間的增加，紅景天苷得率基本不變，超過(guò)10min以后有所下降。因此選擇10min作為最佳微波提取時(shí)間。

圖6 微波時(shí)間對(duì)紅景天苷得率的影響Fig.6 Effect of microwave extraction time on the yield of salidroside

2.3.5 微波功率對(duì)紅景天苷得率的影響 由圖7可知，紅景天苷得率隨著微波功率的增加而有所提高，但超過(guò)400W以后有所下降。因此選擇微波功率400W作為最佳微波功率。

圖7 微波功率對(duì)紅景天苷得率的影響Fig.7 Effect of microwave power on the yield of salidroside

2.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）、微波時(shí)間（X3）編碼值與實(shí)驗(yàn)值間的轉(zhuǎn)換公式為：X1=（Z1-70）/10，X2=（Z2-20）/5，X3=（Z3-10）/2。式中Z1、Z2、Z3分別表示乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間的真實(shí)值。以X1、X2、X3為自變量，紅景天苷得率為響應(yīng)值，采用SAS RSREG程序進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。采用SAS 8.0軟件處理上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得響應(yīng)面圖見(jiàn)圖8～圖10。

由圖8可知，當(dāng)微波提取時(shí)間一定時(shí)，得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比的增加顯示增加，在到達(dá)最高點(diǎn)后，下降明顯。

由圖9可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波提取時(shí)間的增加顯示增加，在到達(dá)最高點(diǎn)后，下降明顯。

由圖10可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，得率隨料液比和微波提取時(shí)間的增加顯示增加，在到達(dá)最高點(diǎn)后，下降明顯。

表2 響應(yīng)面分析方案及數(shù)據(jù)結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)得率影響的響應(yīng)面分析Fig.8 Response surface analysis of volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio on the yield of salidroside

圖9 乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波提取時(shí)間對(duì)得率影響的響應(yīng)面分析Fig.9 Response surface analysis of volume fraction of ethanol and microwave extraction time on the yield of salidroside

圖10 料液比與微波提取時(shí)間對(duì)得率影響的響應(yīng)面分析Fig.10 Response surface analysis of solid-liquid ratio and microwave extraction time on the yield of salidroside

采用SAS RSREG程序?qū)憫?yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=2.208333-0.00375X1+0.008X2+0.00225X3-0.050542X12+0.00225X1X2+0.00225X1X3-0.061542X22+0.01375X2X3-0.042042X32

由表3可見(jiàn)，X22為高度顯著，X12，X32為顯著。同樣對(duì)響應(yīng)值具有較大影響，進(jìn)一步說(shuō)明各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)面的影響不僅僅是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，使用該方程模擬真實(shí)的三因素三水平的分析是可行的。由表3可知，回歸模型也是顯著的。該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9017，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好。

表3 回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

因此，回歸方程可以較好地描述各因素與得率之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。經(jīng)過(guò)計(jì)算得到最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70.39533%，料液比為1∶20.350535，微波提取時(shí)間為10.078562?？紤]到實(shí)驗(yàn)儀器的實(shí)際限制，將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶20，微波時(shí)間為10min，即紅景天苷最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶20，微波時(shí)間為10min。用此數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)最佳條件下的得率為2.21%。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步精確實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照1.2.3.2中的方法做三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，紅景天苷的得率平均可達(dá)2.209%，而擬合的數(shù)學(xué)模型得到的理論預(yù)測(cè)值為2.21%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該模型擬合效果較好，可以得到準(zhǔn)確可靠的提取工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

本文主要以大花紅景天的根為原料，以乙醇為溶媒，采用超聲協(xié)同微波的方法提取紅景天苷，優(yōu)化紅景天苷的提取工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅景天苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)回歸分析確定工藝影響因子，以紅景天苷提取率為響應(yīng)值做響應(yīng)面圖，在分析各個(gè)因素的顯著性和交互作用后，得出最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶20，超聲波時(shí)間20min，微波時(shí)間10min，微波功率400W，在此條件下提取3次，得到紅景天苷的平均得率為2.21%。綜上，采用超聲協(xié)同微波的方法提取紅景天苷取得了較好的效果，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

[1]王偉，蔡銀燕，陳耀.紅景天苷制備工藝的探討[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2007，21（5）：50-52.

[2]范明輝，許時(shí)嬰.紅景天苷納米脂質(zhì)體的制備及若干工藝參數(shù)的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2007，28（11）：189-190.

[3]聶建群，王保興，汪旭，等.微波輔助提取大花紅景天中紅景天苷的工藝研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（5）：35-38.

[4]魏志莉.紅景天的生理特點(diǎn)及保健功能[J].實(shí)用醫(yī)技術(shù)雜志，2011，18（12）：99.

[5]馬濤，郭亞?wèn)|.大花紅景天正丁醇提取物的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19：34-36.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].第一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[7]HAN X，ZHANG T Y，WEI Y，et al.Separation of salidroside from Rhodiola crenulata by high-speedcounter-current chromatography[J].Journal of Chromatography A，2002，971（1/2）：237-241.

[8]戴傳云，劉春玲，徐玉瓊，等.紅景天中高純度紅景天苷制備工藝[J].食品科學(xué)，2009，30（22）：165-167.

[9]趙武奇，殷涌光，梁歧，等.微波輔助提取紅景天苷[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（2）：19-22.

[10]王華田，龔鋼明.食用乙醇常溫浸提法提取紅景天苷[J].食品工業(yè)，2006（3）：34-35.

[11]楊曉艷，蘆啟琴，張曉峰.HPLC法測(cè)定紅景天根皮中紅景天苷的含量[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2008，27（5）：305-306.

[12]胡錦美.紅景天有效成分的提取[J].福州師專(zhuān)學(xué)報(bào)，1999，19（3）：51-54.

[13]陳小明，徐超群.紅景天中紅景天苷的提取工藝研究[J].華西藥學(xué)雜志，2010，25（3）：329-331.

[14]閔建華，曹旻旻，韋冬菊，等.微波輔助提取紅景天苷的工藝研究[J].中草藥，2012，43（8）：1536-1539.

[15]吳少雄，郭祀遠(yuǎn)，李琳，等.超聲波法提取大花紅景天有效成分的工藝研究[J].食品科技，2006（1）：46-49.

[16]王化田，祖元?jiǎng)?，毛子?超臨界CO2萃取紅景天中紅景天苷、苷元酪醇的研究[J].植物研究，2004，24（4）：462-465.

[17]周明，杜欣，楊德，等.超聲波-微波協(xié)同萃取對(duì)靈芝多糖提取率的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（7）：1727-1729.

[18]吉欣，張利娟，李育亮，等.紫外分光光度法測(cè)定高山紅景天根及其浸膏的有效成分[J].化學(xué)研究，2007，18（4）：55-58.

[19]楊道賓，劉麗，賈國(guó)夫，等.紅景天酒中紅景天苷含量的高效液相色譜測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（11）：2799-2800.