王 洋 武利慶 高運(yùn)華 盛靈慧 楊 彬 王 晶 楊 屹

(1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013)

0 引言

食品過敏原屬于食品安全性的范疇，食品過敏原多指那些能對特定人群產(chǎn)生過敏反應(yīng)的食品中的蛋白質(zhì)。據(jù)報(bào)道，90%以上的食品過敏是由蛋、奶、魚、甲殼類、花生、大豆、堅(jiān)果類及小麥這8類常見食物引起[1]。

小麥?zhǔn)侨藗內(nèi)粘ｏ嬍持械闹饕澄飦碓?，也是主要的食物蛋白來源之一，小麥中蛋白含量占其總體的7%～15%。小麥致敏通常會影響皮膚、內(nèi)臟和呼吸道的健康，引起運(yùn)動激發(fā)過敏癥、職業(yè)哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻癥、乳糜瀉腸炎和麻風(fēng)皮膚病等不適[2]。麩質(zhì)蛋白是其主要的致敏成分，根據(jù)其在水醇溶液中的溶解情況，可以分為可溶性的醇溶蛋白和不可溶的麥谷蛋白[3]。醇溶蛋白一般是麩質(zhì)蛋白含量的一半，所以，準(zhǔn)確檢測谷物中醇溶蛋白的含量，就可以得到其麩質(zhì)蛋白的含量。

食品過敏原的體外檢測方法有很多[4]，ELISA法是其中之一，他具有靈敏度高、重復(fù)性好、易操作和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，而且很多過敏原專用的ELISA試劑盒都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化，成為應(yīng)用最多的過敏原檢測方法。其中，雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法應(yīng)用最為廣泛，國內(nèi)外已有很多關(guān)于雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法定量檢測食物中醇溶蛋白含量的報(bào)道[5-8]。

為了考察各個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用ELISA方法檢測食品過敏原數(shù)據(jù)的可比性，澳大利亞計(jì)量院組織了麩質(zhì)蛋白定量檢測國際能力驗(yàn)證。中國計(jì)量科學(xué)研究院參加了此次能力驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)采用的是雙抗夾心ELISA法，用德國拜發(fā)的醇溶蛋白試劑盒測定了比對樣品中的麩質(zhì)蛋白含量并對測定結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀；離心機(jī)；天平；水浴；渦旋儀；排槍。

超純水；異丙醇(色譜純)；乙醇(色譜純)；待測樣品由澳大利亞計(jì)量院提供；麩質(zhì)蛋白提取液和麩質(zhì)蛋白檢測試劑盒RIDASCREEN? Gliadin。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1)根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方法，待試劑盒平衡至室溫后，將樣品稀釋液進(jìn)行1:5稀釋；二抗儲備液進(jìn)行1:11稀釋；洗滌緩沖液進(jìn)行1:10稀釋，備用。

2)根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確稱取0.25g樣品，加入2.5mL提取液，60℃水浴15min。加入7.5mL 68%異丙醇，60℃恒溫水浴10min；60℃水浴10min；2500g離心10min；取80μL上清液，加920μL樣品稀釋液，混勻待測。

3)在酶標(biāo)板每孔加入100μL標(biāo)準(zhǔn)或樣品溶液，室溫孵育1小時(shí)；每孔用250μL洗滌液洗滌三次；每孔加入100μL酶-偶聯(lián)物，室溫反應(yīng)40min；每孔用250μL洗滌液洗滌三次；每孔加入50μL底物和50μL顯色劑，微微震蕩板，室溫暗反應(yīng)40min；每孔加入100μL停止液，在450nm測定吸光度。

1.3 結(jié)果計(jì)算

試劑盒直接測定出的結(jié)果為提取稀釋后溶液中的醇溶蛋白的含量，通過式(1)根據(jù)稱取樣品的質(zhì)量、樣品溶液體積和稀釋倍數(shù)可計(jì)算出樣品中的醇溶蛋白含量：

χGliadin=cGliadin×a×V/m

(1)

式中，cGliadin為稀釋液中醇溶蛋白的含量；a為稀釋倍數(shù)；V為樣品溶液體積；m為稱取的樣品質(zhì)量。

根據(jù)麩質(zhì)蛋白由50%谷蛋白和50%醇溶谷蛋白組成，將測定出的醇溶蛋白含量乘以2即得到樣品中麩質(zhì)蛋白的含量：

χGluten=2χGliadin

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 試劑盒的選擇與評價(jià)

近年來，市場上已有多種商品化的麩質(zhì)過敏原ELISA檢測試劑盒銷售，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)麩質(zhì)過敏原的定性和半定量檢測。但是，大多數(shù)是利用抗體與小麥中的Ω-醇溶谷蛋白片段反應(yīng)，因而不能等量檢測大麥或黑麥中的醇溶谷蛋白。經(jīng)調(diào)研，最終選擇了德國拜發(fā)公司的RIDASCREEN麩質(zhì)提取檢測試劑盒，該試劑盒符合食品法典修訂標(biāo)準(zhǔn)并獲得AOAC商品化試劑盒的認(rèn)證，也是歐盟食品法典的強(qiáng)制執(zhí)行方法。

為了保證樣品分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，進(jìn)行能力驗(yàn)證樣品分析前，首先對試劑盒定量的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、定量限、檢出限和線性范圍等指標(biāo)進(jìn)行了評價(jià)和驗(yàn)證。以試劑盒自帶的0ng/g、5ng/g、20ng/g、40ng/g麩質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將10ng/g麩質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作為未知樣，進(jìn)行評價(jià)實(shí)驗(yàn)。評價(jià)實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行3天，每天進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。計(jì)算10ng/g麩質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值的誤差作為準(zhǔn)確度的指標(biāo)；計(jì)算日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)作為重復(fù)性的指標(biāo)；以3倍0ng/g麩質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度計(jì)算檢出限；以10倍0ng/g麩質(zhì)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度計(jì)算定量限。試劑盒的各評價(jià)參數(shù)見表1?？梢娫撛噭┖袑?～40ng/g范圍內(nèi)的麩質(zhì)蛋白具有較好的定量能力，能夠滿足此次能力驗(yàn)證樣品的測定要求。

表1 試劑盒定量能力評價(jià)參數(shù)

2.2 能力驗(yàn)證樣品中麩質(zhì)蛋白含量的測定

此次能力驗(yàn)證共發(fā)放兩個(gè)盲樣，均為研磨后混合均勻的食品粉末，每個(gè)樣品各50g。按照所述實(shí)驗(yàn)步驟完成樣品的提取、測定，并按照1.3的方法計(jì)算樣品中麩質(zhì)蛋白的含量。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)兩個(gè)樣品分別稱取3個(gè)子樣，每個(gè)子樣平行測定3次，總共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，盲樣S1為高值樣品，S2為低值樣品，低值樣品中的醇溶蛋白含量低于檢出限。高值樣品日內(nèi)變異系數(shù)為3.13%～3.76%，日間變異系數(shù)為4.45%，如表3所示。

表2 比對樣品中麩質(zhì)蛋白含量的測定

表3高值樣品中麩質(zhì)蛋白含量測定結(jié)果

2.3 不確定度評價(jià)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算的數(shù)學(xué)模型為式(1)。根據(jù)數(shù)學(xué)模型，不確定度主要來自醇溶蛋白濃度的測定、稀釋因子、加樣體積和樣品稱量。

2.3.1 醇溶蛋白濃度測定

醇溶蛋白濃度測定的不確定度主要來源于方法的重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。醇溶蛋白一共測定了3組，每組測定了9個(gè)數(shù)據(jù)，共得到27個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終結(jié)果為這27個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。采用A類不確定度評定方法計(jì)算吸光度重復(fù)性的不確定度分量(n=27)：

根據(jù)文獻(xiàn)[9]計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b中斜率a和截距b的不確定度：

ua=0.77μg/g，ub=0.94μg/g

所以，由醇溶蛋白濃度測定帶來的不確定度為：

2.3.2 稀釋因子

在實(shí)驗(yàn)過程中，分別使用檢定合格的100μL和1000μL的移液器移取80μL樣品和920μL樣品稀釋液進(jìn)行樣品稀釋。根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，100μL和1000μL移液器的最大允許誤差分別為±2.0%和±1.0%，按照均勻分布估計(jì)，由此帶來的稀釋因子的不確定度為：

2.3.3 樣品溶液體積

樣品溶液體積總共為10mL，由10mL的移液器分別移取2.5mL和7.5mL的液體得到，根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，10mL移液器的最大允許誤差分別為±0.6%，按照均勻分布估計(jì)，由此帶來的樣品體積的不確定度為：

2.3.4 樣品稱量

根據(jù)JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》，實(shí)驗(yàn)過程中采用6位數(shù)天平稱量0.25g樣品，其最大允許誤差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于移液器引入的不確定度分量，因此，可忽略由樣品稱量引入的不確定度。

2.3.5 不確定度合成

標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為以上不確定度分量的合成：

取擴(kuò)展因子k=2，對應(yīng)于95%的置信概率，則擴(kuò)展不確定度：

Urel=kuc,rel=0.24；U=0.24×18.9=4.5μg/g

最終測定結(jié)果為：(18.9±4.5)μg/g。

2.4 能力驗(yàn)證結(jié)果

此次能力驗(yàn)證由澳大利亞計(jì)量院主導(dǎo)，來自世界各國的共11家實(shí)驗(yàn)室參加了此次能力驗(yàn)證，其中有9個(gè)實(shí)驗(yàn)室上報(bào)了測定結(jié)果。所有實(shí)驗(yàn)室均采用ELISA方法進(jìn)行測定，測定的目標(biāo)蛋白均為醇溶蛋白，結(jié)果如表4和圖1所示。

表4 各實(shí)驗(yàn)室樣品測定結(jié)果

S2樣品為空白樣品，只要測定過程中沒有污染，測定結(jié)果就不會出現(xiàn)問題，所有參加實(shí)驗(yàn)室都成功完成了S2樣品的測定。S1為澳大利亞計(jì)量院的定值樣品，定值結(jié)果為(17.6±2.6)mg/kg(見圖1)，所有參加實(shí)驗(yàn)室中只有中國計(jì)量科學(xué)研究院和8號實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果中心值落在樣品定值結(jié)果范圍內(nèi)。

圖1 S1樣品中麩質(zhì)蛋白含量測定結(jié)果

為了更加科學(xué)合理的對能力驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行評價(jià)，澳大利亞計(jì)量院同時(shí)采用了z值和En值評價(jià)各家實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果。z值和En值的計(jì)算公式分別如下：

(4)

(5)

式中，x為各參加實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果；X為比對樣品的賦值結(jié)果；σ為樣品賦值結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，σ=X·CV；Ux為樣品賦值結(jié)果的擴(kuò)展不確定度；Uχ為測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度。

若z≤2，說明結(jié)果可信；23，說明結(jié)果不可信；En≤1，說明結(jié)果可信；En>1，說明結(jié)果不可信。各實(shí)驗(yàn)室的z值和En值分別如圖2和圖3所示。

圖2 z值分布圖

若按z值評價(jià)(圖2)，中國計(jì)量科學(xué)研究院以及實(shí)驗(yàn)室3、5、7、8、9的z≤2，證明這些實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果可靠；若按En值評價(jià)(圖3)，中國計(jì)量科學(xué)研究院以及實(shí)驗(yàn)室8、9的En≤1，說明這些實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果可靠。不論采用z值還是En值評價(jià)，中國計(jì)量科學(xué)研究院以及實(shí)驗(yàn)室8、9的結(jié)果都與澳大利亞計(jì)量院結(jié)果一致，通過了此次能力驗(yàn)證。此次食品過敏原能力驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明中國計(jì)量科學(xué)研究院已具備準(zhǔn)確測定食品中麩質(zhì)蛋白過敏原的能力。

圖3 En值分布圖

3 結(jié)論

過敏原是當(dāng)前食品安全面臨的一大問題，快速、準(zhǔn)確定量食品中的過敏原具有重要的意義。中國計(jì)量科學(xué)研究院參加澳大利亞計(jì)量院組織的本次過敏原國際能力驗(yàn)證，就是為了檢驗(yàn)自身的食品過敏原檢測能力。驗(yàn)證結(jié)果表明中國計(jì)量科學(xué)研究院的測定結(jié)果與主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果等效，證明了中國計(jì)量科學(xué)研究院已具有較好的麩質(zhì)蛋白過敏原定量測定能力。

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