劉瑛穎 隋志偉 王 晶 傅博強

(中國計量科學研究院，北京 100013)

0 引言

近年來，全球農業(yè)生物技術產業(yè)取得了巨大發(fā)展，轉基因作物種植面積逐年上升。轉基因大豆為主要種植的轉基因作物，2009 年種植面積達到6920萬公頃，占全世界轉基因作物種植面積的52%[1]。

大豆品系GTS 40-3-2是由加拿大孟山都公司(Monsanto)開發(fā)的，它使得在大豆種植中可以選用草甘膦做除草劑。GTS40-3-2抗草甘膦轉基因大豆是通過農桿菌介導方法，將矮牽牛Ti 質粒(CaMy)中35S啟動子控制epsps 基因導入到大豆植株，培育成的新大豆品種，其含有的4個來源于土壤細菌(Agrobacteriumspp.CP4)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-膦酸合成酶(epsps)基因，是草甘膦抗性的主要來源[2]。

轉基因大豆在全球范圍的迅猛發(fā)展也使其食用安全和環(huán)境安全問題引起了各國政府和相關國際組織的高度重視，紛紛出臺了轉基因生物安全管理相應的法規(guī)，對轉基因植物檢測技術的靈敏度和準確性提出了高標準嚴要求。目前農業(yè)部已經頒布了轉基因大豆定性PCR檢測方法的國家標準，而我國卻缺乏轉基因大豆產品的標準物質，這就要求加快對轉基因大豆GTS40-3-2標準物質的研制。轉基因大豆GTS40-3-2標準物質的研制可用于轉基因大豆檢測和安全評價、實驗室質量控制、轉基因大豆GTS40-3-2的定量檢測等領域。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

主要試劑：Taqman PCR master mix試劑盒(美國ABI)，內標基因引物、外源基因引物和TaqMan 探針(上海英峻)，植物基因組提取試劑盒(天根生物)。3個水平的轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質和純陽性材料由上海交通大學提供。

主要儀器：定量PCR儀 AB7900。

1.2 實時定量PCR擴增體系和條件

根據植物基因組提取試劑盒說明書提取大豆粉中的DNA，經過紫外分光光度計測量DNA濃度、凝膠電泳觀察DNA完整性。參考相關文獻[3-5]并通過實驗選擇并優(yōu)化了插入外源序列特異性引物、探針，選擇大豆內源性基因設計并優(yōu)化引物和探針，結果如表1所示。

表1 Taqman探針實時PCR檢測引物和探針序列信息

續(xù)表

擴增體系如表2所示，擴增程序為：95℃，300s；95℃，15s，60℃，60s，45個循環(huán)。

表2 GTS40-3-2結構特異性與大豆內標準基因的熒光定量PCR擴增體系

1.3 標準曲線和測量結果計算

將陽性轉基因大豆GTS40-3-2提取的基因組DNA作為標準品，根據下面的公式換算成基因組DNA拷貝數濃度，通過梯度稀釋法配制成5個濃度梯度的標準溶液，以拷貝數為橫坐標和擴增得到的Ct值(每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數)為縱坐標繪制標準曲線?？截悢涤嬎愎剑?/p>

Cp=6.02×1023×CDNA/Mw

式中，CDNA為測定的樣本基因組DNA濃度；Mw為基因組分子量大小，大豆基因組大小為1100Mb。

根據得到的內外源基因的拷貝數計算轉基因成分的含量，公式如下：

膠塞體系泵入井筒后，隨著溫度的上升和時間的延長以及泵注的剪切攪動，稠化劑逐漸溶解，交聯中心離子逐漸釋放，膠塞體系逐漸成膠，最終形成具有高強度和黏彈性的固體膠狀物(見圖2)，120℃下的初始黏度達30000 mPa·s以上。由于稠化劑濃度較高，且成膠前交聯劑已與稠化劑充分混合，最終使得半乳甘露聚糖與交聯劑中心離子形成較為致密的空間網狀結構，表現為高黏彈性的固體狀。

轉基因產品的含量(%)=測試樣品中外源基因的拷貝數/(測試樣品中內源基因的拷貝數×內標比)×100%

1.4 室內重復性檢查

驗證實驗室用建立的定量PCR方法對轉基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個梯度水平的9個樣品進行了定量分析，以進一步確認建立的PCR定量方法能進行轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質的定值。

1.5 多家實驗室定值

選擇有資質的實驗室參加協(xié)同實驗，實驗室選擇的原則是：1)通過ISO/IEC 17025的認可或CNAS-CL01:2006的資質、農業(yè)部認可；2)或者參加過能力驗證計劃；3)或者經盲樣測試合格。

2 結果與討論

2.1 定量PCR實驗方法確認

經驗證實驗室研究，轉基因大豆GTS40-3-2內、外標準基因定量PCR的擴增效率在0.85以上，線性相關系數在0.99以上，說明構建的標準曲線適合于轉基因大豆GTS40-3-2樣品的定量檢測。所有樣品定量分析的相對標準偏差RSD(%)在25%以內，說明轉基因大豆GTS40-3-2定量PCR方法的重復性能夠滿足定量的要求[5](見表3)。

表3 轉基因大豆GTS40-3-2定量PCR檢測的重復性結果

2.2 協(xié)同實驗結果

參與聯合定值的各實驗室分別對轉基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個水平的轉基因玉米樣品每種各三瓶進行測定，每瓶進行不少于3次的重復測試。各家實驗室協(xié)同比對結果如表4～表6所示，參與實驗室的室內標準偏差均達到了標準[5]。參與實驗室使用了不同定量PCR儀器，主要為ABI系列和Roche。通過上述建立的PCR實驗方法，各實驗室不同的PCR儀器均得到了好的擴增效率和線性相關系數，進一步說明該定量PCR體系適用于不同的PCR儀器，具有很好的穩(wěn)定性。

表4 轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質水平A的協(xié)同實驗結果

表5 轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質水平B的協(xié)同實驗結果

表6 轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質水平C的協(xié)同實驗結果

2.3 室間精密度分析

對各實驗室返回的數據進行統(tǒng)計分析，轉基因大豆GTS 40-3-2A、B、C三個水平的實驗室間定量PCR的相對標準偏差分別為28.08%、24.29%、32.88%。根據格拉布斯準則從統(tǒng)計上剔除離群值后[6]，重新進行室間精密度分析，轉基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個水平的實驗室間定量PCR的相對標準偏差分別為22.72%、17.83%、27.24%。均小于35%，轉基因大豆GTS40-3-2實時熒光定量PCR方法的室間精密度能夠滿足定量要求[5]。

3 不確定度評定

3.1 A類不確定度uA評定

該分量是通過測量數據的標準偏差、測量次數及所要求的置信水平按統(tǒng)計方法計算出的不確定度。通過剔除多家實驗室定值結果中的離群數據之后，各實驗室的數據平均值等精度，因此，A類不確定度的具體計算方法如下：

轉基因大豆GTS 40-3-2的A，B，C三個含量水平的多家實驗室量為：uA(A)= 0.001002；uA(B)=0.001618；uA(C)= 0.00841。

3.2 B類不確定度uB評估

B類不確定的主要來源包括：1)移液器帶來的不確定度；2)標準溶液系列稀釋帶來的不確定度；3)內外源標準曲線擴增引入的不確定度；4)標準物質引入的不確定度。

3.3 均勻性的標準不確定度uH評估

ν1=m-1

ν2=m(n-1)

經計算，A、B、C三個水平的均勻性的標準不確定度分別為:uH(A)=0.202%；uH(B)=0.380%；uH(C)=0.231%。

3.4 穩(wěn)定性的標準不確定度uS評估

4℃儲存條件下，6個月內在五個時間點上(0、1、2、4和6個月)對轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質考察了穩(wěn)定性。以穩(wěn)定性考察的時間為x軸，以標準物質相應時間的特性值為y軸，擬合成一條直線。直線的斜率為b1，截距為b0。

斜率的不確定度s(b1)通過下式計算[8]：

穩(wěn)定性對不確定度的貢獻為：uS=s(b1)t

式中，t為穩(wěn)定性的考察時長(月)。

轉基因大豆GTS40-3-2基體標準物質穩(wěn)定性分別產生的標準不確定度，A水平，uS=0.346%；B水平，uS=0.033%；C水平，uS=0.108%。

3.5 合成標準不確定度評定

考慮到四部分標準不確定度相互獨立，根據下面公式合成標準不確定度。

A、B、C三個水平定值部分的合成標準不確定度分別為：

u(A)=0.41%，u(B)=0.41%，u(C)=0.91%

4 結論

對轉基因大豆GTS40-3-2定量PCR方法進行了室內研究。組織了7家有資質實驗室對轉基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個水平的基體標準物質進行了多家定值，對多家定值的數據進行了統(tǒng)計分析。經過統(tǒng)計分析得出，轉基因大豆GTS40-3-2A、B、C三個水平的轉基因含量及標準不確定度分別為：水平A定值結果為 1.08%，不確定度為0.82%(k=2，p=95%)；水平B定值結果為 2.22%，不確定度為0.82%(k=2，p=95%)；水平C定值結果為 7.56%，不確定度為1.82%(k=2，p=95%)。

[1] 鐘金傳，吳文良，夏友富.全球轉基因大豆發(fā)展概況.生態(tài)經濟，2005(10)

[2] Monsanto Company.Crop Year/Fiscal Year Financials：Consolidated Restatement Financials.http://www.monsanto.com/monsanto/layout/investor/crop_year/default.asp,2005

[3] Philippe Corbisier，Stefanie Trapmann，David Gancberg，Liesbeth Hannes，Pierre Van Iwaarden，Gilbert Berben，Heinz Schimmel，Hendrik Emons.Quantitative determination of Roundup Ready soybean (Glycine max)extracted from highly processed flour.Anal Bioanal Chem.2005，383(2)，282-290

[4] Swiss Food Manual (Schweizerisches Lebensmittelbuch)

[5] European Network of GMO Laboratories.Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing.2008

[6] ISO Guide 35:2006，Reference materials-general and statistical principles for certification

[7] 全浩，韓永志．標準物質及其應用技術(第二版)[M]．北京：中國標準出版社，2003

[8] 中國標準物質管理委員會.標準物質定值原則和統(tǒng)計學原理[M].北京：中國質檢出版社，2011