夏 亮, 王莉穎, 翟明珠, 吳 迪, 王玉同, 朱 霞*

（第四軍醫(yī)大學(xué): 1心理學(xué)教研室; 2人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室; 3西京醫(yī)院急診科, 西安 710032）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是一種嚴(yán)重的災(zāi)難性事件或威脅（如戰(zhàn)爭及自然災(zāi)害等）所引發(fā)，其主要癥狀為反復(fù)發(fā)生的闖入性記憶再體驗(yàn)、回避及持續(xù)的警覺性增高癥候群[1]。眾多文獻(xiàn)報(bào)道，目前主要治療PTSD的抗抑郁藥物能增加海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。作為大腦中數(shù)量較多的細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞如何參與PTSD的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用單次延長應(yīng)激（single-prolonged stress，SPS）建立大鼠PTSD模型，利用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達(dá)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的指標(biāo)，通過研究海馬內(nèi)GFAP的表達(dá)變化，來探討海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與PTSD的發(fā)病過程，并探討成纖維細(xì)胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）在治療PTSD的焦慮或抑郁樣行為中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠（均由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量在250～300g，鼠齡均為8周，各組動(dòng)物的數(shù)量如圖1所示。

1.2 動(dòng)物模型的建立與FGF2給藥

根據(jù)SPS方法建立模型[2]，即首先對(duì)大鼠進(jìn)行2h的緊密束縛，隨后進(jìn)行15min的強(qiáng)迫游泳，直至大鼠暫時(shí)喪失運(yùn)動(dòng)功能，休息10min后進(jìn)行乙醚麻醉至意識(shí)喪失，然后把動(dòng)物放回鼠籠靜養(yǎng)。正常大鼠在SPS期間禁食水。在建立SPS模型后第7d（SPS 7d）清晨，給予腹腔注射FGF2因子（Protech公司，美國），其劑量為50μg/kg大鼠體質(zhì)量。單次給藥結(jié)束后，將動(dòng)物放回飼養(yǎng)室。在建立SPS模型后第14d（SPS 14d）時(shí)，將三組動(dòng)物（正常、SPS 14d和SPS+FGF2組大鼠）給予行為學(xué)檢測后處死，按照免疫組化和Western印跡法取材。

1.3 行為測定

（1）曠場實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Blokland方法[3]，在直徑為1.5m×1.5m的黑暗曠場上方放置攝像頭，監(jiān)視動(dòng)物在曠場內(nèi)的活動(dòng)情況，采集視頻后由軟件計(jì)算分析各項(xiàng)行為指標(biāo)。具體為將大鼠放在曠場觀察箱中，給予10s的適應(yīng)期后，開始記錄大鼠行為15min，分析大鼠在中央的活動(dòng)時(shí)間及距離。（2）高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevated plus maze，EPM）：參照Komada等[4]的方法，采用上海移數(shù)公司分析系統(tǒng)分析動(dòng)物的各項(xiàng)行為指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)將大鼠放于EPM的中央平臺(tái)上，且鼠頭統(tǒng)一朝向?qū)?cè)開臂，5s適應(yīng)期后，開始記錄其行動(dòng)5min，記錄大鼠在開臂停留時(shí)間占總時(shí)間百分比以及大鼠進(jìn)入開臂的次數(shù)百分比等行為學(xué)指標(biāo)，在SPS造模結(jié)束后7d時(shí)測試正常組和SPS組的EPM和曠場實(shí)驗(yàn)，并且在SPS造模結(jié)束14d時(shí)測試正常組、SPS組和SPS+FGF2組的EPM和曠場實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫熒光染色

造模結(jié)束后第14d取腦切片，大鼠經(jīng)生理鹽水、4%多聚甲醛灌注，取腦并置于4%多聚甲醛溶液中后固定4～6h，移入30%蔗糖PBS溶液中4℃保存。待標(biāo)本沉底后作腦冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚30μm。每只動(dòng)物取連續(xù)5張切片，進(jìn)行GFAP的免疫熒光染色。切片用0.01mol/L PBS漂洗3×10min后，分別加入單克隆小鼠抗GFAP（1∶4000，Chemicon公司）和單克隆小鼠抗NeuN（1∶4000，Chemicon公司）4℃孵育48h后，再放在搖床上孵育過夜；孵育后用0.01mol/L的PBS漂洗3×10min，加入驢抗小鼠Alexa 488在室溫下孵育6h；用PBS漂洗3×10min后，使用熒光封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯）拍照，為減少誤差，所有組的切片都在相同染色和拍照條件下進(jìn)行。三組動(dòng)物均在SPS 14d時(shí)取腦進(jìn)行免疫熒光染色。

1.5 Western印跡法測定蛋白

按照實(shí)驗(yàn)分組，將大鼠快速開顱取腦，冰上分離海馬，加入含PMSF的單去污裂解液，勻漿裂解30min，將勻漿裂解液移入2.0ml離心管，13000×g、4℃離心5min，留取上清液，分裝于0.5ml離心管，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定，確定含10μg蛋白的上樣體積。蛋白樣品采用10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，加入預(yù)染Marker，根據(jù)預(yù)染Marker的位置確定所需蛋白GFAP、NeuN及β-actin的位置，將所需蛋白條帶剪下，然后將膠上蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上做免疫雜交反應(yīng)（PVDF膜預(yù)先在甲醇中浸泡5min）。用含5%的脫脂奶粉的封閉液4℃過夜，然后加入鼠抗GFAP抗體（1∶4000，Chemicon公司），鼠抗β-actin（1∶100，Santa Cruz公司），4℃過夜后使用TBST洗膜，加入驢抗鼠Alexa Fluor 488（1∶500，Santa Cruz公司）對(duì)GFAP標(biāo)記的膜進(jìn)行孵育2h，加入驢抗鼠的Alexa Fluor 594（1∶500，Santa Cruz公司）對(duì)另外一張NeuN標(biāo)記的PVDF膜進(jìn)行孵育2h。后用TBST進(jìn)行洗滌，10min/次，共3次。最后在博士德公司的Bio-Rad成像系統(tǒng)中進(jìn)行熒光條帶的掃描，并使用該軟件進(jìn)行分析，分析熒光密度值，以GFAP或NeuN與β-actin的熒光密度值之比來比較GFAP或NeuN蛋白的表達(dá)量。正常組和SPS+FGF2組均在SPS 14d時(shí)進(jìn)行取材，而SPS組在SPS 7d和SPS 14d分別取材。

1.6 圖像分析

使用激光共聚焦成像系統(tǒng)對(duì)海馬GFAP免疫陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞拍照，計(jì)算單個(gè)視野下GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量。每個(gè)部位隨機(jī)測試8張切片，每張切片選取8～12個(gè)視野（每1個(gè)視野面積約為50000μm2）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，行為學(xué)和形態(tài)學(xué)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均數(shù)比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

SPS 7d組和SPS 14d組大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的中央停留距離和中央停留時(shí)間均顯著低于正常組（均P＜0.01)。正常SPS+FGF2給藥組與正常組在曠場實(shí)驗(yàn)中的兩指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A和B）。

2.2 各組大鼠EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

與正常組相比，SPS 7d組和SPS 14d組大鼠在EPM中的開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂停留時(shí)間百分比顯著降低。與SPS 14d相比，SPS+FGF2給藥組開臂進(jìn)入次數(shù)百分比和開臂停留時(shí)間百分比顯著升高（均P＜0.01；圖1C和D）。

2.3 GFAP和NeuN在海馬的免疫熒光表達(dá)分析

應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測GFAP在海馬的表達(dá)情況。GFAP陽性細(xì)胞呈綠色。在正常組及SPS+FGF2組中，海馬出現(xiàn)大量GFAP陽性細(xì)胞（圖2C和F），并且所有這些陽性細(xì)胞都是星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖2）。與此相比，SPS 組大鼠海馬內(nèi)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少（圖2B和E）。提示SPS模型組顯著抑制海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。正常組（圖2A和D）與SPS+FGF2組（圖2C和F）海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目接近。而神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN的表達(dá)在三組中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光強(qiáng)度分析結(jié)果表明，SPS組大鼠海馬區(qū)的GFAP熒光強(qiáng)度與正常組和SPS+FGF2組的差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其表達(dá)明顯降低，而海馬區(qū)NeuN的熒光強(qiáng)度結(jié)果在三組間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；表1）。

2.4 GFAP和NeuN的Western印跡法結(jié)果分析

Western印跡法檢測GFAP含量（熒光密度值），結(jié)果顯示：與正常組比較，SPS 7d組GFAP表達(dá)明顯減少[（0.957±0.070）vs（0.365±0.055），P＜0.01]；SPS 14d組GFAP的表達(dá)（0.297±0.050）也明顯減少（P＜0.01）；SPS+FGF2組的GFAP（0.939±0.076）與正常組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖3）；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPS 7d與SPS 14d組間GFAP表達(dá)的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western印跡法檢測NeuN含量的結(jié)果顯示，正常組、SPS 7d組、SPS 14d 組和SPS+FGF2組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖1 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)及EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Figure 1 Comparison of results in the open field test and elevated plus maze test in all groups

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中非常重要的一大類細(xì)胞群體。而目前認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞在大腦信息處理及與神經(jīng)元構(gòu)成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的過程中發(fā)揮重要作用[5]，一個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞能與多個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行信息交流，而且它們?cè)趯I養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)侥X中起到了關(guān)鍵作用，而任何通過血腦屏障的化學(xué)物質(zhì)或藥物都必須首先與星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行接觸[6,7]。近年的最新研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞在抑郁癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[8-10]，而且在臨床研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者的GFAP的表達(dá)明顯減少[11,12]。但星形膠質(zhì)細(xì)胞是否參與PTSD的發(fā)病過程，目前國際上尚無相關(guān)報(bào)道。在本研究中，SPS模型組海馬GFAP免疫反應(yīng)陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，且GFAP蛋白表達(dá)明顯降低，通過FGF2給藥后，PTSD模型大鼠的焦慮或抑郁樣行為明顯減輕，伴隨GFAP的表達(dá)上調(diào)，由此可見，海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞在PTSD發(fā)病過程中起重要作用。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和NeuN免疫熒光染色Figure 2 Immunofluorescent staining of GFAP and NeuN (green)in rat hippocampus (scale bar: 100μm)

表1 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和NeuN熒光強(qiáng)度分析Table 1 Immunofluorescence intensity of GFAP and NeuN in rats hippocampus of three groups (n＝6,±s)

表1 各組大鼠海馬區(qū)GFAP和NeuN熒光強(qiáng)度分析Table 1 Immunofluorescence intensity of GFAP and NeuN in rats hippocampus of three groups (n＝6,±s)

注: 與正常組比較, **P＜0.01; 與SPS 14d組比較, #P＜0.05

組別 GFAP NeuN正常組 93.12±9.63 183.12±27.68 SPS 14d組 41.35±7.64** 173.12±24.45 SPS+FGF2組 83.12±8.37# 193.12±18.32

圖3 海馬組GFAP和NeuN表達(dá)的Western印跡結(jié)果圖Figure 3 Western blot analysis of GFAP and NeuN expression in hippocampus

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到，SPS組大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)中的中央停留路程、中央活動(dòng)時(shí)間明顯減少，EPM迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SPS大鼠開臂進(jìn)入次數(shù)的百分比和開臂停留時(shí)間百分比均明顯縮短，說明SPS大鼠的探究行為受到抑制，回避和恐懼、焦慮水平增高，環(huán)境適應(yīng)能力下降，這些癥狀都與PTSD發(fā)病的核心癥狀相似，與既往研究結(jié)果一致[13]。研究表明，腦室注射FGF2能明顯改善大鼠抑郁狀態(tài)[14,15]，而全身性的皮下注射FGF2同樣能減少大鼠的恐懼記憶的鞏固，并促進(jìn)恐懼記憶的消退[16]。本研究采用高劑量單次FGF2腹腔注射，F(xiàn)GF2是否能通過血腦屏障進(jìn)行到腦區(qū)發(fā)揮作用成了關(guān)鍵問題，而文獻(xiàn)表明FGF2作為一種生長因子，能通過血腦屏障發(fā)揮作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性FGF2能增加星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)[18]，我們的研究結(jié)果說明FGF2可能成為新型的PTSD的治療藥物，其機(jī)制為調(diào)節(jié)了GFAP的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

本研究提示FGF2通過激活海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞來參與PTSD的治療過程。但是FGF2通過何種途徑進(jìn)入海馬區(qū)，而且如何調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，這些問題還有待進(jìn)一步研究。

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