焦華琛 張?zhí)N慧 李運(yùn)倫

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NFκB)是一種多效可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，除了能夠調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)、產(chǎn)生細(xì)胞因子，還能調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。NF-κB 對(duì)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和生長(zhǎng)、細(xì)胞粘附和細(xì)胞凋亡所必需的多種細(xì)胞因子、粘附因子具有調(diào)節(jié)作用。前期多項(xiàng)研究表明:炎癥因子NF-κB 在心血管疾病的發(fā)生過(guò)程中具有重要的意義。同時(shí)，NF-κB 在腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)的產(chǎn)生中也起重要作用。為觀察NF-κB 與房顫發(fā)生的關(guān)系，筆者進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

SD 大鼠40 只，體重(250 ±20)g 左右，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)3CX1〈魯〉2009001?？ㄍ衅绽蓮V州白云山制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)110754。青蒿酯由西安小草植物科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)SC101213。戊巴比妥鈉由上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司進(jìn)口分裝，批號(hào)57330。RIPA 裂解液由碧云天生物技術(shù)研究所提供，批號(hào)P0013B。Trizol 試劑盒由生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1102111W。

1.2 動(dòng)物模型建立及分組

SD 大鼠按數(shù)字隨機(jī)表法分為空白對(duì)照組10只，模型組10 只、青蒿酯組10 只、卡托普利組10只，采用氯化鈣、乙酰膽堿混合液以舌下靜脈給藥的方式建立房顫動(dòng)物模型。用1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉，先描記大鼠正常心電圖。舌下靜脈注射氯化鈣、乙酰膽堿混合液1 mL·kg-1，描記心電圖，待出現(xiàn)典型房顫f 波。模型組、青蒿酯組、卡托普利組的30 只大鼠均按此方法每日給藥，常規(guī)喂養(yǎng)，連續(xù)給藥4 周，停藥后心電圖仍有典型房顫改變?yōu)樵炷３晒Α? 組各有9 只大鼠造模成功。實(shí)驗(yàn)前2 周青蒿酯組以1.25 g 生藥/kg 灌胃?？ㄍ衅绽M以3.25 mg/kg 灌胃?？瞻讓?duì)照組實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)為9 只。

1.3 PCR 引物設(shè)計(jì)［2］

選用肌動(dòng)蛋白-β(β-actin)作為內(nèi)參照。Trizol法提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度及含量。引物序列如下:NF-κB:正向 5'-TCTGAGACTCCGTGAAA-3'，反向 5'-CAGACTGACTTTATGGGAAC-3'。52℃退火，循環(huán)30 次，擴(kuò)增片段285 bp。β-actin:5'-GCTGTCCCTGTACGCCTCTG-3'，反向5'-GCTTCTCCTTGATGTCCCGC-3'。59℃退火，循環(huán)30 次，擴(kuò)增片段230 bp。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，換算成mRNA 濃度。

1.4 Western-blot 法檢測(cè)NF-κB 表達(dá)

實(shí)驗(yàn)當(dāng)日處死動(dòng)物，取左心房組織［1］，制成勻漿，使用RIPA 裂解液，再加入100 mg/L 蛋白酶抑制劑提取組織蛋白，并測(cè)定蛋白濃度。制作12%的分離膠和5%的積層膠，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉3 小時(shí)，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBS-T 溶液洗膜4次，每次15 分鐘。室溫下加二抗孵育2 小時(shí)，洗膜4 次，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析并得出灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。NFκB 表達(dá)以灰度值統(tǒng)計(jì)，NF-κB mRNA 表達(dá)計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 房顫大鼠心肌NF-κB mRNA 表達(dá)結(jié)果顯示:模型組與對(duì)照組采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行分析，在NF-κB mRNA 表達(dá)方面相比P ＜0.05(P =0.024)，證明房顫大鼠心肌中NF-κB mRNA 的表達(dá)較正常大鼠明顯增加。青蒿酯組與模型組采用t 檢驗(yàn)分析，兩組相比P ＜0.05(P =0.018)，說(shuō)明青蒿提取物可明顯降低炎癥因子NF-κB mRNA 的表達(dá)，卡托普利與模型組采用t 檢驗(yàn)分析，兩組相比P ＞0.05(P =0.061)，即說(shuō)明卡托普利對(duì)該因子的表達(dá)沒(méi)有影響。

表1 各組大鼠心肌NF-κB mRNA 的表達(dá)(±s)

表1 各組大鼠心肌NF-κB mRNA 的表達(dá)(±s)

注:與對(duì)照組相比，aP ＜0.05;與模型組相比bP ＜0.05;與模型組相比cP ＞0.05

模型組對(duì)照組青蒿組卡托普利組NF-κB 0.92 ±0.08a 0.23 ±0.10 0.36 ±0.08b 0.91 ±0.07 c

2.2 Western-blot 法檢測(cè)房顫大鼠心肌NF-κB 表達(dá)

正常情況下，大鼠心肌中有一定NF-κB 表達(dá)，在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組NF-κB 表達(dá)的灰度值是最低的，青蒿酯組次之，模型組最高?；叶戎翟降停鞍妆磉_(dá)的水平越高。因此可以得出結(jié)論:房顫發(fā)生后，心肌NF-κB 的表達(dá)明顯增強(qiáng)。四組間經(jīng)單因素方差分析，證明青蒿酯能夠有效降低炎癥因子NFκB 的表達(dá)(P =0.034，P ＜0.05)，而卡托普利對(duì)NF-κB 沒(méi)有影響(P =0.067，P ＞0.05)。蛋白表達(dá)及灰度值直方圖見(jiàn)圖1、2。

圖1 房顫大鼠心肌細(xì)胞NF-κB 蛋白的表達(dá)

圖2 房顫大鼠心肌細(xì)胞NF-κB 表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=9)

3 討論

NF-κB 與動(dòng)脈粥樣硬化、心衰、缺血再灌注等心血管疾病有密切的聯(lián)系。NF-κB 是一種重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子，它可與多種蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的κB 序列特異結(jié)合，誘導(dǎo)基因表達(dá)增強(qiáng)。NFκB 是由p50 和p65 兩個(gè)蛋白亞基組成，是炎癥反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)物［3］。NF-κB 激活通路廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞中。NF-κB 是1986年從B 淋巴細(xì)胞核中檢測(cè)到的一種核蛋白因子，它能與免疫球蛋白κ 的輕鏈基因增強(qiáng)子κB 序列特異性地結(jié)合，故稱為NF-κB［4］。

NF-κB 是TGF-β 的上游調(diào)控因子。活化的NFκB 進(jìn)入細(xì)胞核后能夠促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄，可高效誘導(dǎo)多種成分的表達(dá):(1)細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-6 等;(2)黏附分子，如ICAM-1、VCAM-1 等;(3)趨化因子;(4)急性反應(yīng)蛋白;(5)調(diào)控炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的酶［5］。

NF-κB 與心律失常關(guān)系密切。前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，房顫大鼠心肌TNF-α 的表達(dá)是上調(diào)的，青蒿酯與卡托普利均能減低TNF-α 的表達(dá)。NF-κB 是TNF-α 的上游調(diào)節(jié)因子。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上以青蒿酯作為研究對(duì)象，觀察青蒿酯對(duì)房顫大鼠心肌中NF-κB 表達(dá)的干預(yù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn):正常大鼠心肌中有少量NF-κB 表達(dá)，房顫發(fā)生后，心肌NF-κB mRNA 的表達(dá)明顯增強(qiáng)。青蒿酯能夠有效降低炎癥因子NF-κB mRNA的表達(dá)(P ＜0.05)，而卡托普利對(duì)NF-κB mRNA 沒(méi)有影響(P ＞0.05)。Westing-blot 法的結(jié)果證明這證明青蒿提取物降低TNF-α 是通過(guò)干預(yù)NF-κB 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而卡托普利并非通過(guò)這一途徑實(shí)現(xiàn)的。

［1］ 姜楠，梁曉春，屈嶺，等.筋脈通膠囊對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)測(cè)量學(xué)及核轉(zhuǎn)錄因子κB 蛋白表達(dá)的影響［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5(2):100-104.

［2］ 趙凱，錢(qián)月慧，程曉東.TNF-α、NF-κB 在動(dòng)脈粥樣硬化閉塞癥兔動(dòng)脈中的表達(dá)變化［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(1):14-16.

［3］ 陳志成，陳國(guó)忠，吳曉智，等.上胸段硬膜外阻滯對(duì)蛛網(wǎng)膜下隙出血兔基底動(dòng)脈NF-κB 和COX-2 表達(dá)的影響［J］. 醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(14):2279-2282.

［4］ 李恩，劉宗芳，孫利強(qiáng)，等.CT-1、NF-κB 在心肌梗死大鼠心室重塑中的表達(dá)及羅格列酮的作用［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，32(1):54-56，92.

［5］ Siebenlist U，F(xiàn)ranzoso G，Brown K，et al.Structure，regulation and function of NF-κB［J］. Annu Rev Cell Biol，1994，10:405-455.