莊魯江 孫江兵 周軍

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻的干燥葉，羅布麻葉營養(yǎng)豐富，富含羽扇豆醇、金絲桃苷、三葉豆苷、多種氨基酸、多糖、維生素等成分。其中黃酮類物質(zhì)為羅布麻葉主要的有效部位，近幾年研究表明羅布麻葉總黃酮具有抗氧化、抗衰老、抗血栓、抗腫瘤、降血脂、抗輻射和促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等作用［1-4］。本實(shí)驗(yàn)研究羅布麻葉總黃酮對腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用，為進(jìn)一步開發(fā)和利用羅布麻葉這一中藥資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性Wistar 大鼠，體重280～320g，(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號:SYXK 均2007-023)。于清潔級鼠類實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂食，自由攝食與飲水，室溫調(diào)節(jié)于25℃左右。

1.2 試藥

羅布麻葉總黃酮(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院自制，總黃酮含量為85%)。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測試盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為分析純級。

1.3 儀器

BP210S 電子天平(賽多利斯公司);UV-1800PC紫外分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司);DGSY 電熱恒溫水浴鍋(北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);CP100WX 超速冷凍離心機(jī)(日本日立公司);SK5200LHC 超聲處理器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);RE-3000C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.4 分組及給藥

將45 只Wistar 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、羅布麻總黃酮(20、40、80 mg/kg)劑量組。給藥組動物先連續(xù)灌胃給藥5 天，每天一次。模型組給予等量的生理氯化鈉溶液(10 ml/kg)灌胃5 天，每天一次。第5 天給藥1 小時后施行手術(shù)，根據(jù)Longa 等報道的方法，建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型［5-6］。

1.5 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型制備

大鼠7%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)，結(jié)扎ECA 與CCA，用動脈夾夾閉ICA 遠(yuǎn)心端后，迅速于距ECA 與ICA 分叉處約0.5 cm 的頸總動脈處作一切口，插入一端涂有石蠟的尼龍線(直徑為0.28 mm)，插入深度為(18.5 ±0.5)mm，實(shí)現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎入口處，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。2小時后輕輕向外提拉所留線頭至略有阻力以實(shí)現(xiàn)大腦中動脈再灌注。在缺血2 小時和再灌注0.5 小時內(nèi)用電熱毯維持大鼠肛溫在36.5～37.5℃。假手術(shù)與其他模型鼠一樣分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，但只結(jié)扎CCA。模型成功按以下標(biāo)準(zhǔn):(1)大鼠左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失;(2)提尾倒懸時左上肢向胸前屈曲;(3)行走時左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈;(4)右側(cè)出現(xiàn)霍納氏征(Honer's)。

1.6 取材

取造模成功的動物，用3.5%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，剪開胸腔暴露心臟，剪開心包膜，用恒流泵經(jīng)過心臟灌注生理鹽水約200 ml，4%多聚甲醛緩沖固定液300 ml，之后立刻斷頭取腦，放入-4℃含4%多聚甲醛緩沖固定液40 分鐘，70%酒精固定，隨后梯度酒精脫水、石蠟包埋，制作石蠟切片(片厚8 μm)。

1.7 HE 染色

將石蠟切片制作的標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，程序如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟下行至蒸餾水中待染;切片置蘇木素染液5 分鐘，自來水洗去多余的染料;切片放入鹽酸酒精中數(shù)秒鐘，水洗;切片入氨水溶液中至細(xì)胞核變藍(lán);將返藍(lán)的切片充分水洗，去掉堿性物質(zhì)，然后入1%伊紅水溶液中5 分鐘，洗去多余的伊紅;顯微鏡下觀察核漿染色對比清晰后梯度酒精脫水、封片。光鏡下觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化。

1.8 生化指標(biāo)測定

腦缺血2 小時再灌注24 小時斷頭，于冰盤上取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，去除嗅球與低位腦干，稱重后，以生理鹽水1 ∶9 在冰水浴中勻漿制成10%腦組織勻漿，分裝，低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。取出勻漿化凍后按各測定指標(biāo)要求處理得上清夜，按照試劑盒說明書所示方法分別測定上清夜中MDA 含量、CAT 含量、SOD 活性、GSH-Px 活性。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用考馬斯亮藍(lán)法測定各樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析處理，所有計量數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P ＜0.05 時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織病理形態(tài)學(xué)變化

光鏡下，假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)無異常，胞膜、核膜清晰，核仁明顯。腦缺血再灌注模型組神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫樣改變，細(xì)胞間隙增寬，缺血腦組織舒松，空泡樣變明顯，胞體皺縮呈三角形，核固縮或溶解;中心區(qū)神經(jīng)元脫失明顯，殘存細(xì)胞多無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在羅布麻葉總黃酮各劑量組神經(jīng)細(xì)胞僅有輕、中度缺血性改變，細(xì)胞腫脹程度、間隙及胞核改變均較對照組輕。缺血中心區(qū)神經(jīng)元脫失現(xiàn)象明顯減輕，周邊區(qū)皮層細(xì)胞的形態(tài)接近正常，并呈劑量依賴性。見圖1。

2.2 CAT、SOD、GSH 和MDA 測試結(jié)果

腦缺血再灌注模型組CAT、SOD 和GSH 活性明顯低于假手術(shù)組，MDA 含量明顯高于假手術(shù)組，經(jīng)SNK-q 檢驗(yàn)比較差異具有統(tǒng)計數(shù)意義［q 值分別為5.78、4.23、5.64、4.97 均＞q0.05 (2.89)，P ＜0.05］。羅布麻葉總黃酮各劑量組腦組織CAT、SOD、GSH 活性和MDA 含量與假手術(shù)組經(jīng)SNK-q 檢驗(yàn)比較差異無統(tǒng)計數(shù)意義［比較CAT，q值分別為2.01(80 mg/kg 組)，2.15(40 mg/kg 組)，2.37(20 mg/kg 組);比較SOD，q 值分別為1.24(80 mg/kg 組)，1.65(40 mg/kg 組)，1.98(20 mg/kg組);比較GSH，q 值分別為1.73(80 mg/kg 組)，2.06(40 mg/kg 組)，2.24(20 mg/kg 組);比較MDA，q 值分別為1.59(80 mg/kg 組)，1.82(40 mg/kg 組)，2.01(20 mg/kg 組)均＜q0.05(2.89)，P ＞0.05］。羅布麻葉總黃酮各劑量組腦組織CAT、SOD、GSH活性和MDA 含量與腦缺血再灌注模型組經(jīng)SNK-q檢驗(yàn)比較差異具有統(tǒng)計數(shù)意義［比較CAT，q 值分別為5.36(80 mg/kg 組)，5.06(40 mg/kg 組)，4.51(20 mg/kg 組);比較SOD，q 值分別為4.01(80 mg/kg 組)，3.55(40 mg/kg 組)，3.19(20 mg/kg組);比較GSH，q 值分別為5.21(80 mg/kg 組)，4.77(40 mg/kg 組)，4.23(20 mg/kg 組);比較MDA，q 值分別為4.51(80 mg/kg 組)，4.23(40 mg/kg組)，3.89(20 mg/kg 組)均＞q0.05(2.89)，P ＜0.05］。見表1。

圖1 羅布麻葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的腦組織病理改變的影響(HE ×400)

表1 羅布麻葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷后MDA、CAT、SOD 和GSH-Px 活性的影響(n=8，±s)

表1 羅布麻葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷后MDA、CAT、SOD 和GSH-Px 活性的影響(n=8，±s)

注:與假手術(shù)組比較aP ＜0.05;與模型組比較bP ＜0.05

組別MDA(mg/mL)CAT(U/mg)SOD(U/mg)GSH-Px(mg/g)假手術(shù)組1.37 ±0.411.56 ±0.68223.18 ±20.1212.37 ±2.27腦缺血再灌注模型組2.31 ±0.53a0.51 ±0.49a179.27 ±21.04a6.64 ±2.48a總黃酮80 mg/kg 組1.41 ±0.89b1.59 ±0.84b227.43 ±47.67b12.78 ±2.28b總黃酮40 mg/kg 組1.68 ±0.62b1.35 ±0.59b209.57 ±31.31b10.04 ±2.64b總黃酮20 mg/kg 組2.02 ±0.47b1.08 ±0.73b191.34 ±22.43b7.27 ±3.04 b

3 討論

黃酮類化合物是一類廣泛分布于自然界的重要天然有機(jī)化合物。許多植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，其對植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果及防菌防病等方面起著重要的作用。近年的研究表明黃酮類化合物具有多種生物活性，如降低血管脆性及異常的通透性，擴(kuò)冠、抗血小板凝集、抗心律失常、抗自由基氧化、抗炎鎮(zhèn)痛和保肝等作用。隨著對中藥研究的不斷擴(kuò)大和深入，發(fā)現(xiàn)一些黃酮類化合物具有防治腦缺血病的作用［7-9］。

羅布麻葉總黃酮是從夾竹桃科羅布麻屬羅布麻的干燥葉中所提取的活性部位，主要成分有金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、蕓香甙、異槲皮苷、三葉豆苷、紫云英苷、異槲皮苷-6’-O-乙酰基、三葉豆苷-6’-O-乙酰基等，其中以金絲桃苷含量最高。近年來研究表明，槲皮素和金絲桃苷等成分具有抗腦缺血的作用［10-12］，但是羅布麻葉總黃酮對腦缺血的影響尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)通過羅布麻葉總黃酮對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷保護(hù)作用的研究，發(fā)現(xiàn)羅布麻葉總黃酮各劑量組均能減輕缺血/再灌注所致大鼠腦組織的病理變化，能抑制腦神經(jīng)細(xì)胞水腫、溶解、細(xì)胞核模糊和固縮等，其中以高劑量組(80 mg/kg)效果最好。同時，本研究觀察到，大鼠腦組織缺血2 小時，再灌注24 小時后，組織中氧化性指標(biāo)MDA 含量明顯增加，而抗氧化酶CAT、SOD 和GSH-Px 活力明顯降低。與模型組比較，羅布麻葉總黃酮各劑量均能不同程度提高腦缺血/再灌注損傷時腦組織中的CAT、SOD 和GSH-Px 活性，以及降低MDA 含量，表現(xiàn)出良好的抗氧化作用。提示羅布麻葉總黃酮對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷有顯著保護(hù)作用，其保護(hù)作用與羅布麻葉總黃酮能降低腦內(nèi)氧自由基水平、控制脂質(zhì)過氧化程度有關(guān)。本研究為羅布麻葉總黃酮進(jìn)一步用于腦缺血疾病的救治提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ 曾斌芳，田莉，燕雪花.新疆羅布麻的藥理作用和現(xiàn)代應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009，18(2):11-13.

［2］ 吳向起，楊新波，楊解人，等.羅布麻提取物藥理活性的研究進(jìn)展［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2009，25(5):435-438.

［3］ 蔡玉鑫，阿依別克·馬力克，肖正華. 羅布麻花化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2007，38(9):1306-1307.

［4］ 鄭永紅，韋曉瑜，龍繼紅. 羅布麻葉中黃酮類成分研究進(jìn)展［J］.今日藥學(xué)，2010，20(8):5-7.

［5］ Nagasawa H，Kogure k. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion［J］. Stroke，1989，20(8):1037-1043.

［6］ 羅勇，董為偉.Wistar 大鼠插線法局灶腦缺血/再灌注模型的實(shí)驗(yàn)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，27(1):1-4.

［7］ 李麗靜，吳曉光，商亞珍.山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，30(2):148-151.

［8］ 王遠(yuǎn)，王海桃.銀杏葉總黃酮對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國執(zhí)業(yè)藥師，2012，9(11):25-28.

［9］ 徐愛鈺，陳從顯，許勇，等.雞血藤總黃酮大鼠腦缺血的保護(hù)作用［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，35(5):338-341.

［10］ 鄒毅清，聶海貴，張福清，等. 金絲桃苷預(yù)處理大鼠全腦缺血再灌注后神經(jīng)行為學(xué)的研究［J］. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18(12):1340-1342.

［11］ 吳志國，畢方方，楊曉蘇，等.槲皮素對腦缺血再灌注后FADD蛋白表達(dá)的影響［J］. 神經(jīng)疾病與精神衛(wèi)生，2007，7(1):1-2，6.

［12］ 陳志武，趙維中，宋必衛(wèi)，等. 蕓香甙對腦缺血再灌損傷的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報，1998，14(1):81-83.