陳通威，胡明明

·技術(shù)與方法·

降低人血白蛋白制品中PKA的方法初探

陳通威，胡明明

人血白蛋白臨床主要用于治療燒傷、失血引起的休克，防止低蛋白血癥及肝硬化或腎病引起的水腫或腹水[1]。劉雋湘[2]認(rèn)為人血白蛋白制品中存在兩種毒性物質(zhì)：一種是熱原質(zhì)，一種就是激肽釋放酶原激活物（PKA）。PKA 是血漿因子 XII 被激活后釋放出的 β-XIIa 肽段[3]。PKA 能激活激肽釋放酶原（PK），使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧る尼尫琶福↘），激肽釋放酶再將高分子激肽原（HMWK）水解，釋放出具有生物活性的激肽（BK）[4]。激肽對(duì)人體具有一定的副作用，它可引起心血管及外周血管擴(kuò)張，肺毛細(xì)血管收縮，血壓下降，局部疼痛；嚴(yán)重時(shí)引起水泡、呼吸加速等，其中最突出的臨床表現(xiàn)就是引起血壓的下降[2]。鑒于 PKA 的危害性，本文就人血白蛋白制品生產(chǎn)過程中如何降低 PKA 作了一些初步的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 健康人血漿，采自康寶生物長(zhǎng)子單采血漿站。乙醇，藥用，為新鄉(xiāng)市先豐醫(yī)藥新材料有限公司產(chǎn)品；醋酸鈉，藥用，為臺(tái)山市新寧制藥有限公司產(chǎn)品；冰醋酸，藥用，為四川金山制藥有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 設(shè)備與儀器 不銹鋼篩網(wǎng) 200 目，自制。BAX-600血漿分離機(jī)購(gòu)自重慶輕工業(yè)機(jī)械公司；GQ-142 離心機(jī)購(gòu)自上海離心機(jī)研究所；Cuf-600 超濾機(jī)購(gòu)自美國(guó)密理博公司；FYG-5000 反應(yīng)罐購(gòu)自浙江溫兄閥業(yè)公司；1 m3巴氏滅活系統(tǒng)購(gòu)自四川英德生物公司；TU1901 紫外-可見分光光度計(jì)購(gòu)自北京普析通用儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 人血白蛋白制品工藝流程如圖 1 所示。

圖1 人血白蛋白制品工藝流程簡(jiǎn)圖

1.2.2 融漿階段篩網(wǎng)處理 原料血漿中含有一定量的PKA，血漿中的纖維蛋白原在融漿過程中特別容易活化為纖維蛋白凝塊，對(duì) PKA 具有一定的吸附作用。在融漿過程中，我們對(duì)融化血漿使用 200 目不銹鋼篩網(wǎng)過濾截留纖維蛋白凝塊，以期達(dá)到截留 PKA 的目的。

1.2.3 組分 IV 沉淀的分離階段工藝參數(shù)處理 人血白蛋白生產(chǎn)過程中，組分 IV 沉淀可以帶走大量的 PKA。在組分 IV 沉淀分離階段的工藝控制參數(shù)主要有溫度、乙醇濃度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度和 pH。我們對(duì)組分 I + II + III 上清液采用三種工藝分別生產(chǎn)一批人血白蛋白制品，觀察制品中 PKA 的含量變化。工藝參數(shù)組合情況見表 1。

表 1 工藝參數(shù)組合情況

1.2.4 組分 V 沉淀分離階段工藝處理 組分 V 沉淀的分離方法有兩種，一種是離心法，一種是壓濾法。我們對(duì)組分 IV 上清液用壓濾法與離心法分離組分 V 沉淀，分別生產(chǎn)人血白蛋白制品，觀察制品中的 PKA 含量變化。

1.2.5 病毒滅活階段工藝處理 人血白蛋白的病毒滅活方法是巴氏滅活法，即對(duì)半成品進(jìn)行 60 ℃ ，10 h 連續(xù)加熱。加熱可能滅活 PKA，人血白蛋白半成品進(jìn)行巴氏滅活、巴氏滅活后以 60 ℃ 繼續(xù)加熱 2 h、巴氏滅活后以 62 ℃ 繼續(xù)加熱 2 h、巴氏滅活后以 63 ℃ 繼續(xù)加熱 2 h 處理，觀察制品中 PKA 含量變化。

1.2.6 PKA 檢測(cè)方法及其限度要求 采用顯色底物法，用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 405 nm 處測(cè)定供試品中激肽釋放酶原激活物（PKA）含量[5]。依據(jù)《中國(guó)藥典》2010 版要求，人血白蛋白制品中 PKA 含量應(yīng)不高于 35 IU/ml[6]。

2 結(jié)果

2.1 融漿階段篩網(wǎng)處理結(jié)果

經(jīng)不銹鋼篩網(wǎng)過濾前、后的血漿分別用相同工藝生產(chǎn)人血白蛋白并進(jìn)行 3 次測(cè)定，結(jié)果無顯著差異（P < 0.05），見表 2。

表 2 不銹鋼篩網(wǎng)處理前后制品的 PKA 含量（IU/ml）

2.2 組分 IV 沉淀分離階段處理結(jié)果

組分 IV 沉淀分離階段采用三種工藝生產(chǎn)的 3 批人血白蛋白制品，每批測(cè)定 3 次，結(jié)果表明，隨著工藝參數(shù)變化，PKA 的含量有明顯變化（表 3）。

表 3 組分 IV 沉淀分離階段不同工藝制品PKA 含量（IU/ml）

2.3 組分 V 沉淀分離階段處理結(jié)果

用壓濾法與離心法生產(chǎn)的 2 批人血白蛋白制品，每批測(cè)定 3 次，結(jié)果表明，離心法生產(chǎn)出來的制品 PKA 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于壓濾法生產(chǎn)的制品（表 4）。

表 4 組分 V 沉淀分離階段壓濾法和離心法制品 PKA 含量（IU/ml）

2.4 病毒滅活階段處理結(jié)果

巴氏滅活后保溫處理結(jié)果表明，巴氏滅活后對(duì)制品繼續(xù)以 60 ℃ 加熱 2 h 未見 PKA 減少，而經(jīng) 62 ℃ 和 63 ℃加熱 2 h 后，PKA 下降明顯（表 5）。

表 5 巴氏滅活后不同溫度處理 2 h對(duì)白蛋白制品 PKA 的影響（IU/ml）

3 討論

自采血分離血漿開始，由于凝血反應(yīng)被啟動(dòng)，PKA 就隨之產(chǎn)生。如使用未經(jīng)硅化處理的玻璃器具，采血時(shí)不注意將血液與抗凝劑充分混合，在采血分漿過程中發(fā)生了凝血反應(yīng)等原因都可以使原料血漿中的 PKA 含量大大增加。原料血漿在轉(zhuǎn)運(yùn)過程和在庫(kù)保存期間容易造成反復(fù)凍融，Suontaka 等[7]報(bào)道，輸血用血漿在 4 ℃ 保存期間發(fā)生冷激活，在冷激活中激肽釋放酶樣活性增加。在融漿過程中，纖維蛋白原特別容易活化為纖維蛋白變性而凝塊，纖維蛋白凝塊對(duì) PKA 具有一定的吸附性。200 目篩網(wǎng)基本能夠截留比較細(xì)小的纖維蛋白凝塊。但采用 200 目篩網(wǎng)過濾原料血漿的方法，未能有效降低 PKA，可能與融漿時(shí) PKA 在血漿中溶解度較大，而過濾的方式太過簡(jiǎn)單有一定的關(guān)系。

在組分 IV 沉淀分離階段，降低反應(yīng)溫度，能減少蛋白質(zhì)變性，改變反應(yīng)的 pH 值和乙醇濃度，能對(duì)需要沉淀的蛋白質(zhì)做出選擇。工藝 3中反應(yīng)溫度降低，pH 值降低，乙醇濃度增高的處理方法，恰能使組分 IV 上清液中雜蛋白含量減少，白蛋白純度明顯提高，有利于白蛋白質(zhì)量的提高，降低人血白蛋白制品中 PKA 的含量。其缺點(diǎn)是人血白蛋白的提取收率下降。組分 V 沉淀分離階段，采取離心法分離能明顯減少組分 V 沉淀中的雜蛋白，提高白蛋白純度，從而降低人血白蛋白制品中 PKA 的含量。這與劉雋湘[2]報(bào)道的 Cohn 低溫乙醇法參數(shù)變化對(duì)人血白蛋白提取的影響結(jié)果相符合。但是在采取不同的工藝參數(shù)或制作方法時(shí)，由于人血白蛋白的提取收率不同，企業(yè)為最大化地利用寶貴的血漿資源，應(yīng)選擇合適參數(shù)，在一定程度上減少白蛋白制品中PKA 的含量。

PKA 的前體是血漿因子 XII，60 ℃ 的高溫可以滅活血漿因子 XII，從而造成 PKA 的失活。但是 PKA 對(duì)熱有很高的穩(wěn)定性，60 ℃，10 h 巴氏滅活還不能達(dá)到有效滅活PKA 的目的。制品經(jīng)巴氏滅活，再進(jìn)行 62 ℃ 或 63 ℃ 延長(zhǎng) 2 h 加熱后，能達(dá)到最大化的降低 PKA 的目的。這也提示我們，可以對(duì)人血白蛋白制品的病毒滅活工藝進(jìn)行改進(jìn)，使其同時(shí)起到滅活病毒和降低 PKA 的作用，從而達(dá)到提升人血白蛋白制品質(zhì)量的目標(biāo)。

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國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典. 2010年版三部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:213.

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·行業(yè)動(dòng)態(tài)·

科學(xué)家進(jìn)一步證實(shí)SARS病毒來源于中華菊頭蝠

近期中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所石正麗研究員帶領(lǐng)的國(guó)際研究團(tuán)隊(duì)分離到一株與 SARS（Severe acute respiratory syndrome coronavirus）病毒高度同源的 SARS 樣冠狀病毒（SARS-like CoV），進(jìn)一步證實(shí)中華菊頭蝠是 SARS 病毒的源頭。

SARS 冠狀病毒是造成 2002 - 2003 年 SARS 暴發(fā)的病原，造成全球 8094 人感染和 774 人死亡的重大疫情。已有的流行病學(xué)證據(jù)和生物信息學(xué)分析顯示，野生動(dòng)物市場(chǎng)上的果子貍是 SARS 冠狀病毒的直接來源。雖然在世界各地包括非洲、歐洲和中國(guó)的蝙蝠體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)與 SARS 病毒相似的 SARS 樣冠狀病毒，但這些病毒均不能利用人和果子貍的 ACE2（即人SARS 病毒受體）作為受體，不是 SARS 病毒的近親。該團(tuán)隊(duì)分離的 SARS 樣冠狀病毒可以利用人、果子貍和中華菊頭蝠ACE2 作為其功能受體，并且能感染人、豬、猴以及蝙蝠的多種細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中華菊頭蝠是 SARS 冠狀病毒的自然宿主提供了更為直接的證據(jù)。這些最新結(jié)果發(fā)表在 2013 年國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊 Nature。這也是該團(tuán)隊(duì)繼 2005 年在Science 上發(fā)表“蝙蝠是 SARS 樣冠狀病毒自然宿主”之后在此領(lǐng)域的又一項(xiàng)重大突破。該項(xiàng)目得到國(guó)家 973 和基金委重大項(xiàng)目等資助。

研究人員稱，盡管蝙蝠攜帶多種病毒，但這些蝙蝠病毒傳播到人的機(jī)會(huì)并不多。蝙蝠在自然生態(tài)中有很重要的作用，它們能傳播花粉，是害蟲的天敵，從不主動(dòng)攻擊人類。保護(hù)蝙蝠等野生動(dòng)物的生存環(huán)境是遠(yuǎn)離野生動(dòng)物病原感染的最好方式。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.06.014

046011 長(zhǎng)治，山西康寶生物制品股份有限公司

陳通威，Email：ctw001@126.com

2013-08-26