朱志玲，左利民，馮夢雪，山廣志

·綜述·

表面等離子體共振技術(shù)在小分子與靶點相互作用研究中的應用

朱志玲，左利民，馮夢雪，山廣志

近年來，分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展為微觀分子水平上的基于靶點的藥物研究奠定了基礎(chǔ)。小分子藥物通常是信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)劑，它能夠特異性地調(diào)節(jié)信號傳導通路，從而達到治療疾病的目的。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的藥物靶點大約有 500 個[1]，在此基礎(chǔ)之上建立了大量的以藥物作用靶點為研究對象的分子水平的篩選模型，根據(jù)小分子與靶點結(jié)合的特性，來判斷化合物的生物活性，從而篩選出高選擇性的分子靶向藥物。這種基于靶點相互作用的篩選模型可以極大地提高新藥的開發(fā)速度，并且對于闡明小分子與靶點的作用機制具有重要意義。

近年來，在生物物理學快速發(fā)展的驅(qū)動下，以表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)為代表的光學傳感技術(shù)在藥物高通量篩選領(lǐng)域正日益得到廣泛應用，商業(yè)化的 SPR 生物傳感器也為研究分子間相互作用提供了可實踐的平臺。

本文簡述了 SPR 技術(shù)的原理與特點，并就 SPR 技術(shù)在小分子藥物發(fā)現(xiàn)方面的應用進行綜述。

1 表面等離子體共振技術(shù)

表面等離子體共振技術(shù)是 20 世紀 90 年代發(fā)展起來的，應用 SPR 原理檢測生物傳感芯片上配位體與分析物之間相互作用的一種新技術(shù)。表面等離子體（surface plasmons，SPs）是指在金屬表面存在的自由振動的電子與光子相互作用產(chǎn)生的沿著金屬表面?zhèn)鞑サ碾娮邮杳懿?，它不僅能夠被電子，也能夠被光波激發(fā)。

SPR 生物傳感器中使用的表面等離子的激發(fā)方式是棱鏡耦合方式，即金屬薄膜直接鍍在棱鏡面上，入射光在金屬-棱鏡界面處會發(fā)生全反射，全反射的消逝波與表面等離子體波的頻數(shù)和波數(shù)匹配，光的能量便傳遞給表面等離子體，從而激發(fā)出表面等離子體波[2]。在入射角或波長為某一適當值的條件下，表面等離子體與消逝波的頻率和波數(shù)相等，兩者發(fā)生共振，入射光被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰，此時的入射角被稱為 SPR 角。SPR 角隨金屬表面折射率變化而變化，而金屬表面折射率又與其表面結(jié)合的分子量大小成正比，這就是 SPR 生物傳感器對金屬表面結(jié)合物實施檢測的基本原理（圖 1）。

1902 年，Wood[3]首次發(fā)現(xiàn)了 SPR 現(xiàn)象，但 SPR 技術(shù)真正應用于傳感器領(lǐng)域是在 20 世紀末期。1957 年，Ritchie[4]首次發(fā)現(xiàn) SPR 的發(fā)生與金屬薄膜的界面有關(guān)。1971 年，Kretschmann[5]提出了簡單、可靠的 Kretschmann結(jié)構(gòu)，為 SPR 傳感器奠定了基礎(chǔ)，現(xiàn)代大多數(shù) SPR 研究都是基于 Kretschmann 結(jié)構(gòu)。直到 1983 年，Liedberg等[6]首次將 SPR 技術(shù)應用于生化反應和動力學的計算，從而使 SPR 技術(shù)在藥物研究領(lǐng)域得到應用。1990 年，首臺商業(yè)化的 SPR 儀器（商品名：Biacore）由 Pharmacia（現(xiàn)為 GE）研制成功。目前，SPR 生物傳感器已經(jīng)成為藥物靶點確證、分子間相互作用研究以及藥物篩選的有力工具。

圖1 SPR 生物傳感器檢測原理圖（引自 GE 公司 Biacore 材料）

SPR 傳感器通過測量芯片表面折射率的變化來確定分子之間是否存在相互作用，具有實時、無標記等優(yōu)點。利用SPR 技術(shù)可以獲得分子間特異性結(jié)合的一些特征參數(shù)，如：結(jié)合水平、結(jié)合率以及一些熱力學特性和小分子濃度的定量測定。SPR 技術(shù)與其他分子互作分析方法如酵母雙雜交系統(tǒng)（THS）、化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）、雙分子熒光互補（BIFC）等技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：①實時監(jiān)測分子之間結(jié)合情況，并可計算出動力學及親和力數(shù)據(jù)；②樣品無需進行標記，對樣品成分無特殊要求；③獲得的是活性分子之間的互作結(jié)果。

2 SPR 技術(shù)在小分子-靶點相互作用研究中的應用

在小分子與靶點相互作用的研究中，藥物與靶點結(jié)合的動力學特性與藥物治療的效果有很大關(guān)系，先導化合物優(yōu)化的一個主要任務(wù)就是提高候選藥物與靶點的親和力，這就需要全面了解一系列候選化合物的性質(zhì)以及修飾后的化合物與靶點的結(jié)合特性并獲得詳細的動力學參數(shù)，這些數(shù)據(jù)是開展藥物研究及評價的重要環(huán)節(jié)。

SPR 生物傳感器高效、自動化、無標記以及高數(shù)據(jù)分辨率的特點使它成為藥物研究領(lǐng)域的理想儀器。SPR 生物傳感器可以實時監(jiān)測藥物與靶點的結(jié)合過程[7]。通過 SPR生物傳感器可以直接獲得動力學數(shù)據(jù)，并通過動力學數(shù)據(jù)計算得出候選物與靶點蛋白的親和力常數(shù)。

2.1 SPR 技術(shù)用于先導物發(fā)現(xiàn)

新藥的發(fā)現(xiàn)是藥物研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與傳統(tǒng)評價方法相比，SPR 技術(shù)以其免標記、消耗量低、效率高等特點在藥物篩選方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。將 SPR 技術(shù)應用于靶向篩選將有效提高基于靶點的新藥產(chǎn)出量。

SPR 生物傳感技術(shù)用于藥物靶向篩選的一般操作流程是：將靶標分子固定在傳感芯片金膜表面；然后使待篩選物流過芯片表面與靶標相互作用[8]；根據(jù)芯片表面折射率的變化實時監(jiān)測分子互作的整個過程；根據(jù)獲得的親和力數(shù)據(jù)以及動力學參數(shù)對候選物的成藥性進行比較和分析。

Yi 等[9]成功開發(fā)出一種基于 SPR 技術(shù)的 BACE1 酶抑制劑篩選方法，用于治療阿爾茨海默癥藥物的開發(fā)，并成功篩選出兩種 BACE1 的抑制劑。此方法與傳統(tǒng)的熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）方法相比，一方面是能夠更好地模擬神經(jīng)細胞表面 BACE1 與 APP 的結(jié)合；另一方面是大大提高了篩選的效率。利用這種方法，將一個篩選周期縮短到1.5 h，并且在一個芯片表面可以連續(xù)進行 30 h 篩選。

血吸蟲病是一種由寄生蟲引起的疾病，全世界超過200 萬人被感染。目前，治療這種疾病的常用藥物是吡喹酮（PZQ），寄生蟲耐藥性的出現(xiàn)使得研發(fā)新藥成為一項緊迫任務(wù)。Liu 等[10]以日本血吸蟲（schistosom japonicum）的3-氧酰基-ACP 還原酶（sjOAR）作為藥物靶點，并結(jié)合SPR 技術(shù)篩選用于治療血吸蟲病的新藥。他們首先獲得純的 sjOAR 蛋白，并測定酶活力。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特征從14 400 種化合物中篩選出 27 種 sjOAR 蛋白抑制劑。通過Biacore 分析確定 27 種化合物都能與 sjOAR 蛋白結(jié)合，其中有兩種化合物對 sjOAR 酶活性有很強的抑制作用。

烷化劑是一種重要的化療藥物，其細胞毒作用機制主要是烷化劑與生物大分子相互作用后造成 DNA 功能異常。然而，DNA 修復酶的修復功能會使化療效果減弱。Jordheim等[11]借助 Biacore 技術(shù)篩選出一種小分子抑制劑，能夠抑制蛋白質(zhì) ERCC-XPF 相互作用。ERCC、XPF 作為核苷酸切除修復系統(tǒng)的主要組分，其作用受到抑制，間接使烷化劑的治療效果增強。他們通過 Biacore 還闡明了 XPF 是小分子抑制劑的作用靶點，靶點的確定更有利于后續(xù)藥物的靶向篩選。

近年來，隨著 SPR 技術(shù)的興起，越來越多的科研人員借助 SPR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一系列疾病潛在藥物。周躍鋼[12]從鮐魚軟骨蛋白聚糖中制備出糖胺聚糖（主要含硫酸軟骨素）。用 SPR 方法測定了糖胺聚糖與中期生長因子（MK）、肝細胞生長因子（HGF）和多效生長因子（PTN）相互作用的動力學參數(shù)，結(jié)果顯示糖胺聚糖與 MK、HGF 和 PTN 有較高的親和性。這說明鮐魚軟骨糖胺聚糖中含有的 CS 具有潛在的進一步藥用開發(fā)價值，有可能成為藥用硫酸軟骨素的新來源。隨著新一代非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTI）類抗 HIV-1 藥物研制成功，NNRTI 又成為近年來抗 HIV-1病毒新藥研究領(lǐng)域的一個亮點。Geitmann 等[13]將 HIV-1 反轉(zhuǎn)錄酶固定在傳感芯片表面，然后使大量的候選物流過芯片表面。通過這種方法從 1040 種化合物中發(fā)現(xiàn)了 10 種能夠特異性結(jié)合 HIV-1 反轉(zhuǎn)錄酶的小分子藥物。有研究表明，MMP-12 在自體免疫反應所致肺氣腫的發(fā)生發(fā)展中有重要的促進作用[14]。因此，抑制 MMP-12 的活性對肺氣腫疾病有緩解作用。Nordstr?m 等[15]檢測化合物與 MMP-12 的互作過程，利用這種方法成功篩選出兩種先導化合物。已有研究表明 TGF-β 在椎間盤細胞代謝中的重要作用。Kwon等[16]為了研究一種二聚糖衍生肽（P2K）是否影響椎間盤細胞外基質(zhì)代謝。首先利用 Biacore 3000 直接測定了 P2K與 TGF-β1 的相互作用，進一步研究表明 P2K 能夠調(diào)節(jié)TGF-β1 活性進而影響椎間盤細胞 II 型膠原和蛋白聚糖含量。因此，P2K 可以作為一種椎間盤退化性疾病治療的潛在藥物。

2.2 SPR 技術(shù)指導下的小分子藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化

綜合運用計算機虛擬篩選和表面等離子共振技術(shù)快速、高效地發(fā)現(xiàn)特定藥物靶標，為我們開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的I 類新藥打下了良好的基礎(chǔ)。其中 SPR 生物傳感器作為評價手段，能夠確定新合成的化合物的生物活性進而指導進一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化趨勢。

Cai 等[17]為了提高新霉胺對16S RNA 的親和力，合成了一系列 II 環(huán) 5 位修飾的新霉胺類似物。以新霉素 B 為原料，經(jīng)多步反應得到氨基或氨基鏈修飾的新霉胺類似物。然后用 SPR 生物傳感器測定了所合成的化合物與大腸桿菌核糖體 A 位點 rRNA（16S RNA）的相互作用特性。通過測定結(jié)果確定了 6 個 II 環(huán) 5 位修飾的新霉胺類似物，發(fā)現(xiàn)了 II 環(huán) 5 位的氨基鏈修飾可以增強合成的化合物對16S RNA 的親和力。并且確定在新霉胺的 II 環(huán) 5 位引入氨基或脂肪胺可以增加與 16S RNA 的親和力。

周琳等[18]首先合成了一系列苯并噻唑席夫堿類化合物，利用 SPR 技術(shù)檢測這類分子與 β-淀粉樣蛋白（Aβ）的結(jié)合情況，通過優(yōu)化獲得兩種與 Aβ 結(jié)合力較高的化合物。這兩種化合物與 Aβ 較好的結(jié)合性能表明，該類化合物有可能發(fā)展成為小分子探針用于阿爾茨海默病的早期診斷。

補體系統(tǒng)的過度活化產(chǎn)生了多種炎癥介質(zhì)，炎癥介質(zhì)通過多種機制參與疾病的細胞和組織損傷過程，研究出能夠拮抗補體過度活化的高效、安全的補體抑制劑是臨床上亟待解決的重要問題[19]。Qu 等[20]利用 SPR 技術(shù)準確測定了補體抑制劑 compstatin 的一系列衍生物與 C3b 受體相互作用的動力學及親和力常數(shù)，用于評價衍生物的抑制性能。作者利用 SPR 技術(shù)建立了一種指導 compstatin 結(jié)構(gòu)優(yōu)化的高效方法。

2.3 通過 SPR 技術(shù)闡述藥物作用機制

研究藥物作用機制和途徑是藥物開發(fā)的一項重要任務(wù)，利用 SPR 技術(shù)研究化合物與不同蛋白修飾的芯片表面的相互作用，這將有助于發(fā)現(xiàn)和確認藥物作用的新靶點，并幫助人們進行先導化合物的優(yōu)化。

核酸是遺傳信息的載體也是藥物作用的重要靶點，以核酸作為藥物靶標的研發(fā)越來越受關(guān)注。能夠識別 DNA 分子的多聚酰胺是一類人工合成的含吡咯-咪唑的有機小分子，能夠在小溝處特異性識別堿基序列，是一種潛在基因治療靶向藥物[21]。Iguchi 等[22]以 DNA 為模板合成 dsRNAs。然后，利用 Biacore 檢測吡咯-咪唑多聚酰胺與 dsRNAs 的相互作用，測定 KD值為 6.7 × 10-7mol/L，結(jié)果表明吡咯-咪唑多聚酰胺與 dsRNAs 存在特異性結(jié)合，這說明 RNA有可能成為吡咯-咪唑多聚酰胺藥物的潛在靶標。

MMP-9 活性異常將會引起心肌膠原過度降解，從而導致心肌纖維化，因此亟需一種抑制 MMP-9 活性的藥物。Jiang 等[23]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸 A（Sal A）在細胞和動物水平上都能有效抑制 MMP-9 活性。為進一步研究 Sal A 抑制MMP-9 活性的作用位點，他們截取 MMP-9 的一部分區(qū)域（MMP-9 CD）并將其偶聯(lián)到 Biacore 芯片表面，將 Sal A及其他 7 種類似物進行測試，最后發(fā)現(xiàn)只有 Sal A 與MMP-9 CD 有強結(jié)合。Biacore 實驗進一步確定了 Sal A 與MMP-9 相互作用位點并驗證了抑制劑的特異性。

HIV-1 包膜糖蛋白跨膜亞基 gp41 在病毒進入靶細胞的早期環(huán)節(jié)起關(guān)鍵作用，gp41可以作為開發(fā) HIV-1 進入抑制劑的一個重要靶點[24]。王洪濤[25]以 gp41 作為靶標，借助計算機輔助分子對接技術(shù)對一個含有 2 萬種化合物的化合物庫進行初級篩選。隨后，利用 ELISA 對 200 種在對接分析中得分最高的小分子化合物進行次級篩選，獲得一個可能同 gp41 的口袋區(qū)相結(jié)合的抗 HIV-1 的小分子化合物 ADS-J1。最后運用表面等離子體共振實驗，發(fā)現(xiàn) ADS-J1能直接與一個包含 gp41 口袋區(qū)的三聚體多肽 IQN17 結(jié)合，并導致后者的構(gòu)象發(fā)生變化而不能結(jié)合另外一個小的D-肽 PIE7。從而闡述清楚了 ADS-J1 抑制 HIV-1 感染靶細胞作用機制，為開發(fā)設(shè)計更有效的小分子 HIV 進入抑制劑奠定基礎(chǔ)。

3 SPR 芯片的再生

傳感芯片作為 SPR 技術(shù)的核心部件，在芯片表面經(jīng)過多次再生后，偶聯(lián)的配體容易失活或脫落，最終導致芯片廢棄。傳感芯片價格昂貴、使用周期短是導致 SPR 實驗成本過高的主要原因。對 SPR 芯片再生，降低芯片成本將會大大降低 SPR 技術(shù)的應用成本并提高 Biacore 儀器的使用率。

歐惠超等[26]開發(fā)了 Biacore 系列儀器的 5 種不同芯片（CM5、SA、NTA、J1 和C1 芯片）的再生制備方法。并指出利用這種再生方法可以對芯片再生 5 ～ 10 次，再生次數(shù)主要取決于芯片表面金膜的完整性。芯片再生技術(shù)的深度研究將有望大大降低 SPR 實驗的成本，從而促進 SPR技術(shù)在各個研究領(lǐng)域的廣泛應用。

4 結(jié)語

綜上所述，SPR 技術(shù)以其高效、自動化、無標記以及高數(shù)據(jù)分辨率的特點已逐漸成為研究小分子藥物與靶點之間相互作用的有力工具。利用 SPR 生物傳感技術(shù)不僅能夠定性地研究小分子與藥物靶點之間的相互作用過程，而且能夠獲得兩者作用的動力學常數(shù)、親和力常數(shù)以及熱力學性質(zhì)等。這就為從分子水平上進行小分子藥物篩選以及闡明藥物作用機制提供了科學依據(jù)。伴隨 SPR 設(shè)備靈敏度的進一步提升以及芯片再生工藝的日益完善，SPR 技術(shù)作為小分子藥物篩選及靶點確證的工具將在藥物研發(fā)過程中獲得更多應用。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.06.008

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2013-09-12