黃 偉

(鄭州大學(xué)體育學(xué)院，河南鄭州 450044)

心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)由膠原、糖蛋白和蛋白聚糖構(gòu)成，其中膠原含量最為豐富(主要是I型和III型膠原)，其功能主要是:為肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞提供支持，傳導(dǎo)肌細(xì)胞內(nèi)外的機(jī)械應(yīng)力，保證心肌的彈性和順應(yīng)性，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［1］。伴隨著衰老的進(jìn)程，心肌ECM過度沉積導(dǎo)致心肌纖維化，即機(jī)械性重塑和結(jié)構(gòu)性重塑，主要表現(xiàn)為室壁張力增加、彈性下降、心臟充盈期縮短，心臟負(fù)荷增大造成心肌肥大而虛弱、心臟功能進(jìn)行性下降，射血分?jǐn)?shù)減少并易于發(fā)生心律失常和心衰［2］。據(jù)報(bào)道，衰老時(shí)I型膠原含量增加2～3倍，主要與膠原降解減少、合成增加以及成纖維細(xì)胞增殖有關(guān)［2］。

膠原降解和組織重塑是由一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶家族——基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)催化介導(dǎo)的。迄今為止發(fā)現(xiàn)20多種MMPs，心肌主要表達(dá) MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 和MMP-14［3］。MMPs 以無活性的前體(酶原)(Pro-MMPs)形式由心肌細(xì)胞分泌，活化后轉(zhuǎn)變?yōu)镸MPs(active MMPs，本文中的MMPs即指活性MMPs)，降解膠原，從而破壞ECM［3］。MMPs活性主要由內(nèi)源性的組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)調(diào)節(jié)［3］。已有的研究表明，MMPs和 TIMPs功能失調(diào)是各種生理病理過程中(衰老、心衰等)心肌重塑的重要原因［4-5］。心衰時(shí)TIMPs顯著增高，與上游的調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β(transforming growth factor-β，TGF-β)和氧化應(yīng)激有關(guān)［6］。

體力活動(dòng)減少可使心搏出量和心輸出量下降，患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)增加，加速心臟衰老(cardiac aging)。規(guī)律活動(dòng)特別是有氧運(yùn)動(dòng)可通過增加搏出量和心輸出量而有效改善各年齡人群的心功能［7］。此外，有研究顯示［8］，運(yùn)動(dòng)可減少由于增齡造成的心臟膠原積累并與心功能改善有關(guān)聯(lián)，但具體的分子機(jī)理尚不清楚。本研究以衰老大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，利?0周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，目的在于:1)利用病理組織學(xué)方法觀察衰老大鼠規(guī)律運(yùn)動(dòng)后心肌膠原纖維的形態(tài)學(xué)變化;2)利用分子生物學(xué)的方法探討TGF-β/TIMP-1/MMPs信號(hào)通路是否參與了運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與取材

本研究于2010年4月購進(jìn)3月齡健康雄性SPF級(jí)SD大鼠(購自河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)30只后，隨即選取10只為青年對(duì)照組(young control group，YC組)，飼養(yǎng)3天后，稱量體重，用戊巴比妥鈉120 mg/kg麻醉大鼠測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，然后取出心臟，迅速轉(zhuǎn)入液氮中并于﹣80℃低溫冰箱凍存待測(cè)。其余20只飼養(yǎng)至2012年1月(20月齡)制作衰老動(dòng)物模型，將其隨機(jī)分為衰老對(duì)照組(old control group，OC組，n=10)和衰老運(yùn)動(dòng)組(old exercise group，OE組，n=10)。OE組進(jìn)行10周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)方案如下:1周適應(yīng)性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(坡度:0°，速度:5m/min，時(shí)間:10 min/天)后進(jìn)行9周正式運(yùn)動(dòng)(坡度:12°，速度:10.5 m/min，時(shí)間:45 min/天，頻率:5 次/周);OC組處于安靜狀態(tài)10周。末次實(shí)驗(yàn)48 h后麻醉大鼠測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)并取出心臟凍存待測(cè)。本實(shí)驗(yàn)在河南省體育科學(xué)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

PE-50心導(dǎo)管于右側(cè)頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號(hào)采集、處理系統(tǒng)，記錄左心室收縮期壓力(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力最大上升速率(maximaldevelopingrateofleftventricular pressure，+dp/dtmax)和左室壓力最大下降速率(maximal descending rate of left ventricular pressure，-dp/dtmax)。

1.3 心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)測(cè)定

取心臟組織切片，40 g/多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，行Masson染色法使心肌細(xì)胞染成紅色，膠原染成綠色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用圖像分析軟件測(cè)量膠原組織所占百分率(心肌膠原面積/所測(cè)視野面積)，取平均值即為CVF。

1.4 心肌I、III型膠原mRNA表達(dá)測(cè)定

心肌組織勻漿后，用Trizol法抽提總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(美國產(chǎn) ABI 7500型熒光定量 PCR儀)測(cè)定心肌 I、III型膠原mRNA含量，引物參照文獻(xiàn)［9］，內(nèi)參基因 GAPDH。引物序列分別為，I型膠原(1075bp):上游 5'-CAAGAATGGCGACCGTGGTGA-3'，下 游 5'-GGTGTGACTCGTGCAGCCAT-3';III型膠原(450bp):上游5'-AGATGGACTAAGTGGACATC-3';下游5'-CATGTTTCTCCGGTTTCCAT-3';GAPDH(308bp):上游 5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，下游 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ /5 min;94℃ /45 s，56℃ /45 s，72℃ /1 min，共 32個(gè)循環(huán)，終末延伸72℃/10 min。計(jì)算相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct，△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.5 心肌蛋白表達(dá)測(cè)定

心肌組織裂解后提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120 V、80 mA預(yù)電泳10 min，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。1:1000 兔抗大鼠一抗(Pro-MMP-1、2、3、9、14，MMP-1、2、3、9、14，TGF- β 和 TIMP-1)4℃孵育過夜，TBST洗滌PVDF膜，1:1000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，暗室中滴加發(fā)光底物混合物2 mL于PVDF膜上，曝光、顯影、定影。對(duì)目的蛋白進(jìn)行光密度分析，以GAPDH為內(nèi)參。目的蛋白相對(duì)含量=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS 14.0 for Windows)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。顯著性水平取α=0.05和α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表1結(jié)果顯示，與YC組比較，OC組LVSP、±dp/dtmax顯著性下降(均為P＜0.01)，LVEDP則顯著性升高(P＜0.01);與 OC組比較，OE組 LVSP、±dp/dtmax顯著性升高(均為P＜0.01)，LVEDP則顯著性下降(P＜0.01)。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2.2 心肌Masson染色與CVF

Masson染色顯示，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌纖維呈紅色。YC組心肌細(xì)胞著色均勻，無明顯膠原成分;OC組心肌細(xì)胞減少，纖維化程度明顯，CVF顯著高于YC組(P＜0.01);OE組較OC組心肌細(xì)胞增多，膠原纖維(即CVF)顯著減少(P＜0.01)。見圖1。

圖1 各組心肌Masson染色與CVF比較注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

2.3 心肌I、III型膠原mRNA表達(dá)

圖2 各組心肌I、III型膠原mRNA表達(dá)的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與 OC組比較，#P ＜0.05，##P＜0.01。

圖2結(jié)果顯示，與YC組比較，OC組I、III型膠原mRNA均升高(均為P＜0.01);與OC組比較，OE組I、III型膠原 mRNA則降低(分別為 P＜0.01和P ＜0.05)。

2.4 心肌Pro-MMPs、MMPs蛋白表達(dá)

與 YC 組比較，OC 組Pro-MMP-2、MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14降低(均為 P ＜0.01)，Pro-MMP-3、TGF-β 和TIMP-1升高(均為P ＜0.01);與OC組比較，OE組Pro-MMP-2和Pro-MMP-3升高(均為 P ＜ 0.01)，Pro-MMP-14、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-14、TGF-β 和 TIMP-1降低(均為 P＜0.01);Pro-MMP-9和MMP-9在各組均無顯著性差異(均為P＞0.01)。見圖3～圖8。

圖3 各組心肌Pro-MMP-1和MMP-1蛋白表達(dá)的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖4 各組心肌Pro-MMP-2和MMP-2蛋白表達(dá)的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖5 各組心肌Pro-MMP-3和MMP-3蛋白表達(dá)的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖6 各組心肌Pro-MMP-9和MMP-9蛋白表達(dá)的變化

圖7 各組心肌Pro-MMP-14和MMP-14蛋白表達(dá)的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

圖8 各組心肌TGF-β和TIMP-1蛋白表達(dá)的變化注:與YC組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與OC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，10周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)使衰老大鼠心臟I型和III型膠原表達(dá)下調(diào)、CVF下降，MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14表達(dá)上調(diào)以及TIMP-1表達(dá)下調(diào)，心功能得到逆轉(zhuǎn)。此外，本研究還觀察到，正性調(diào)控TIMP-1的上游信號(hào)分子——TGF-β在衰老時(shí)顯著上調(diào)，而運(yùn)動(dòng)則使其表達(dá)下降。上述結(jié)果驗(yàn)證了我們的假設(shè)，即規(guī)律運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可延緩心臟衰老過程中的膠原沉積和心肌纖維化并改善心功能，其機(jī)制與TGF-β/TIMP-1信號(hào)通路受到抑制，MMPs表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老心臟的保護(hù)作用

本研究成功建立衰老大鼠心肌纖維化模型，即與YC組比較，OC組I型和III型膠原mRNA顯著升高，心肌Masson顯示CVF升高，血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定發(fā)現(xiàn)LVSP、±dp/dtmax顯著性下降，LVEDP則顯著性升高，說明機(jī)體衰老的過程中，心臟膠原合成增加，心肌逐漸出現(xiàn)纖維化［10］，心室順應(yīng)性下降伴心臟舒縮功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。

阻遏及逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為防治惡性心血管病事件發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。學(xué)者們嘗試多種方法改善心肌纖維化，例如藥物療法(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、中藥復(fù)方CFX等)［11］、干細(xì)胞技術(shù)［12］均可抑制心室重塑，但藥物存在各種副作用，而干細(xì)胞技術(shù)尚處于實(shí)驗(yàn)階段。近年來，運(yùn)動(dòng)康復(fù)療法在防治心血管疾病中的作用逐漸引起關(guān)注，規(guī)律活動(dòng)可有效改善各年齡人群的心功能，而對(duì)于心臟病患者，有氧運(yùn)動(dòng)則可減輕其臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，降低死亡率和住院率［7］。相比其他手段，運(yùn)動(dòng)療法具有經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、副作用小、易于實(shí)施等特點(diǎn)。有研究顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)心功能的改善作用可能與抑制心臟膠原積累有關(guān)［8，13］。Woodiwiss等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，青年大鼠 16 周經(jīng)過隨意滾輪運(yùn)動(dòng)，心臟僵硬度降低，而膠原含量則無顯著性變化，提示運(yùn)動(dòng)對(duì)健康心臟膠原含量影響不大。Choi等［8］報(bào)道，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)降低了衰老大鼠心臟膠原交聯(lián)(collagen cross-linking)并改善心臟舒張功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，與OC組比較，OE組I型和III型膠原mRNA表達(dá)下調(diào)，CVF下降，雖然血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)尚未恢復(fù)至 YC組水平，但與 OC組比較，LVEDP降低，LVSP、±dp/dtmax升高。上述結(jié)果提示，10周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)通過抑制衰老大鼠心肌膠原合成，延緩甚至逆轉(zhuǎn)了由于衰老造成心肌纖維化和心功能下降，同時(shí)也證實(shí)了臨床運(yùn)動(dòng)康復(fù)療法的積極效果。一項(xiàng)隨訪研究證實(shí)［15］，優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員在70歲時(shí)仍能保持較高的心血管功能，因此，規(guī)律運(yùn)動(dòng)能夠延緩增齡過程中發(fā)生的心臟機(jī)械性和結(jié)構(gòu)性重塑，對(duì)于心功能具有保護(hù)效應(yīng)。

3.2 TGF-β/TIMP-1/MMPs信號(hào)通路參與了運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠心肌的保護(hù)作用

心肌MMPs介導(dǎo)心臟膠原蛋白降解，但MMPs調(diào)節(jié)異常則可造成心肌纖維化、心臟衰老甚至心力衰竭［16］。TIMP-1作為MMPs的內(nèi)源性抑制劑，能夠與活化的MMPs 1:1結(jié)合形成酶-抑制劑復(fù)合物，從而抑制MMPs的蛋白水解活性［16］。研究指出，缺血-再灌注損傷［17］和心梗［18］可同時(shí)上調(diào)心肌MMPs和TIMP-1表達(dá)，而本研究中與YC組比較，OC組雖然Pro-MMPs變化各異(Pro-MMP-3升高，Pro-MMP-2下降，Pro-MMP-1、9、14則無顯著性變化)，但具有活性的MMPs表達(dá)均下降而TIMP-1則升高。這一矛盾結(jié)果說明自然衰老與疾病造成的心臟異常存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，增齡過程中MMPs活性逐漸降低，膠原降解減少，ECM的更替(turnover)速率加快，膠原逐漸沉積甚至出現(xiàn)纖維化;而心臟疾患則造成MMPs升高，可能與心臟瘢痕組織形成有關(guān)［18］。

本研究利用10周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與OC組比較，OE 組 MMP-1、MMP-2、MMP-3和 MMP-14表達(dá)均顯著升高，提示運(yùn)動(dòng)逆轉(zhuǎn)了增齡造成的MMPs下調(diào)表達(dá)，促進(jìn)膠原降解，這可能是運(yùn)動(dòng)對(duì)抗衰老造成的心肌膠原沉積和心肌纖維化并對(duì)衰老心臟起保護(hù)作用(心功能改善)的機(jī)制之一。運(yùn)動(dòng)對(duì)MMPs的作用與TIMP-1有關(guān)，衰老時(shí)TIMP-1升高從而抑制了MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-14的表達(dá)量，而運(yùn)動(dòng)則通過下調(diào)TIMP-1部分解除了對(duì)MMPs的抑制作用，提示TIMP-1/MMPs可能是運(yùn)動(dòng)防治心臟衰老的干預(yù)靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β與心血管疾病密切相關(guān)，心肌特異性表達(dá)TGF-β可導(dǎo)致心肌肥厚和心肌纖維化。血管緊張素II、內(nèi)皮素等引起心肌纖維化的信號(hào)分子均可導(dǎo)致TGF-β增加，因此TGF-β上調(diào)成為諸多因素所致心肌纖維化的共同通路［19］。Brooks等［20］發(fā)現(xiàn)，24月齡TGF-β雜合子小鼠心肌纖維化程度較野生型明顯減輕，生存率和心功能得到改善。藥理研究表明［21］，降低TGF-β表達(dá)則可減弱心肌膠原合成，對(duì)于心肌纖維化具有潛在應(yīng)用價(jià)值。已證實(shí)，TIMP-1是TGF-β下游的效應(yīng)分子，增齡可升高TGF-β表達(dá)量［19］(與本研究結(jié)果一致，即TGF-β在OC組顯著高于YC組)，TGF-β通過上調(diào)TIMP-1表達(dá)參與了心臟衰老過程。運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老過程中心臟TGF-β/TIMP-1信號(hào)通路的影響尚無報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，與OC組比較，OE組TGF-β表達(dá)量顯著下調(diào)，結(jié)合上述結(jié)果，我們推測(cè)，規(guī)律運(yùn)動(dòng)通過抑制TGF-β/TIMP-1上調(diào)MMPs表達(dá)，因此，TGF-β/TIMP-1/MMPs信號(hào)通路參與了運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老大鼠心肌的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

衰老過程中，心臟膠原合成增加、降解減少，膠原含量增多，進(jìn)而造成心肌纖維化和心功能下降;規(guī)律運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練抑制膠原合成并促進(jìn)膠原降解，延緩心臟衰老過程中的膠原沉積和心肌纖維化并改善心功能，其機(jī)制與TGF-β/TIMP-1信號(hào)通路受到抑制，MMPs表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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