黃秀香 覃 玥 黃艷梅

HUANG Xiu-xiangQIN YueHUANG Yan-mei

（河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 河池 546300）

(Departmentof Chemistry and Life Science,Hechi University,Hechi,Guangxi546300,China)

半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)為唇形科黃芩屬植物，主產(chǎn)于江蘇、浙江、福建、廣西和廣東等地，全草入藥。具有解熱、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1]。半枝蓮中的化學(xué)成分主要含有生物堿、糖類及黃酮類化合物[2]。多糖是半枝蓮中一種重要的活性成分，對半枝蓮多糖的提取工藝研究并不多見，而采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取半枝蓮多糖更是少見。由于超聲波有獨特的機械效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)及空化效應(yīng)，以及其粉碎和攪拌的特殊作用[3]；復(fù)合酶對降解細胞壁，不僅有利于多糖的溶出，還可以降低溶液的黏度，從而提高多糖得率，所以本試驗利用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取半枝蓮多糖。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半枝蓮干品：購自廣西宜州市；

葡萄糖標準品：汕頭市西隴化工廠；

鋁片、無水乙醇、95%乙醇、苯酚、碳酸氫鈉、濃硫酸、石油醚(60～90℃)、活性炭、檸檬酸、磷酸氫二鈉：分析純，汕頭市西隴化工廠；

纖維素酶：活性≥1 800 U/mg，上海源葉生物科技有限公司；

果膠酶：活性≥1 000 U/mg，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

微型植物粉碎機：FZ102型，天津市泰斯特儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV－2501型，日本島津公司；

精密pH計：PHS-25型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

電子天平：AL204型，奧豪斯儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 半枝蓮多糖提取工藝

(1)材料預(yù)處理：稱取試樣半枝蓮粉末，按照料液質(zhì)量體積比為1∶3的比例加入石油醚(60～90℃)浸漬4～5 h，脫脂處理，然后進行減壓抽濾，收集濾渣，置烘箱中，在50℃的條件下烘干，12 h后取出，放入干燥器內(nèi)備用。

(2)提取工藝流程：

稱取半枝蓮粉末（10 g）→加100mL蒸餾水→調(diào)節(jié)pH 4.5→加復(fù)合酶（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1∶1）0.020 g→50℃酶解30 min→超聲波作用20 min→沸水浴滅酶→抽濾→脫色→抽濾→95%乙醇沉淀→靜置過夜→洗滌→烘干→得粗多糖→20 mL蒸餾水溶解（50℃）→濃縮（去雜）→乙醇沉淀→無水乙醇洗滌→得精多糖

1.3.2 標準葡萄糖溶液的配制 精密稱取在105℃干燥至恒重的葡萄糖100mg，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用。

1.3.3 苯酚—硫酸法葡萄糖標準曲線的制作 根據(jù)文獻[4]，得回歸方程：A=12.121C+0.008 1(r=0.999 6)，線性范圍0.005～0.015mg/mL，符合線性關(guān)系。

1.3.4 換算因子的測定 精密稱取半枝蓮多糖121 mg于100 mL容量瓶中，加少量蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取配置好的多糖溶液 4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 mL 于50mL容量瓶中，定容后從中分別吸取2 mL于比色管中，再加入1 mL新配置的5%苯酚和5 mL濃硫酸，振蕩，靜置30min后測量其吸光度[5]。按式(1)計算換算因子：

式中：

f——換鼻因子；

W——稱取多糖的質(zhì)量，mg；

C——多糖中葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

D——半枝蓮多糖的稀釋倍數(shù)。

經(jīng)過式(1)求得換算因子為2.70。

1.3.5 多糖得率的計算方法 多糖得率按式(2)計算：

式中：

R——多糖得率，%；

C——半枝蓮多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

D——多糖溶液的稀釋倍數(shù)；

f——換算因子；

W——半枝蓮樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.6 半枝蓮多糖提取單因素條件的研究

(1)pH對多糖得率的影響：準確稱取2.000 0 g半枝蓮粉末，蒸餾水做提取劑，料液比1∶40(m∶V)，并搖勻，分別調(diào)節(jié)pH 為 4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，加入酶量 0.015 g（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1∶1），在50℃水浴下酶解30 min，超聲20min后，沸水浴滅酶10 min，抽濾，用活性炭脫色，減壓抽濾，收集濾液，將濾液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加入蒸餾水定容，按方法1.3.3測其吸光度，計算多糖得率。

(2)復(fù)合酶量對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉 末 2.000 0 g，pH 4.5， 酶 量 0.010，0.015，0.020，0.025，0.030 g（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1∶1），按方法1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

(3)料液比對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉末2.000 0 g，pH 4.5，酶量0.020 g（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為 1∶1），料液比 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60(m∶V)，按方法1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

(4)超聲時間對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉末2.000 0 g，pH 4.5，酶量0.020 g（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為 1∶1），料液比 1∶20(m∶V)，超聲時間10，15，20，25，30，35min，按方法1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

(5)酶解溫度對多糖得率的影響：準確稱取干燥半枝蓮粉末2.000 0 g，pH 4.5，酶量0.020 g（纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為 1∶1），料液比 1∶40(m∶V)，超聲時間 20min，酶解溫度30，40，50，60，70 ℃，按方法 1.3.6(1)提取半枝蓮多糖，計算得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素提取半枝蓮多糖的結(jié)果

2.1.1 pH對多糖得率的影響 由圖1可知，pH在4.0～5.0條件下，酶活性逐漸升高，與底物作用的速度加快，當pH值達到5.0時，多糖的得率達到最大值；隨著pH值繼續(xù)增大，多糖的得率開始下降。這可能是因為pH值過高或過低都會影響酶的活性，從而造成多糖得率的下降。

圖1 pH對多糖得率的影響Figure 1 Effectof pH on the extraction yield

2.1.2 復(fù)合酶量對多糖得率的影響 由圖2可知，隨著復(fù)合酶量的增加，復(fù)合酶與底物接觸機會增加，多糖得率隨之升高；復(fù)合酶量大于0.020 g時，得率開始下降。這可能是由于當酶含量升高到一定程度，酶分子過于飽和，一部分沒有機會與底物結(jié)合，酶解速度降低[6]，得率下降。

2.1.3 料液比對多糖得率的影響 由圖3可知，料液比為1∶20～1∶40(m∶V)時，多糖得率隨溶劑量比例的增大而升高，之后繼續(xù)增大料液比，酶濃度降低，酶與底物的結(jié)合不充分，多糖得率下降。

2.1.4 超聲時間對多糖得率的影響 由圖4可知，半枝蓮多糖的得率隨超聲時間的增加，有所提高，20min后，多糖得率呈現(xiàn)下降。因為長時間超聲會使多糖分子在超聲波的剪切作用下發(fā)生破壞或降解。

圖2 復(fù)合酶用量對多糖得率的影響Figure 2 Effectof compound enzyme dosage on the extraction yield

圖3 料液比對多糖得率的影響Figure 3 Effect of ratio of scutellaria barbata D.Don to ethanol on the extraction yield

圖4 超聲時間對多糖得率的影響Figure 4 Effectof ultrasonic time on the extraction yield

圖5 酶解溫度對多糖得率的影響Figure 5 Effectof enzymolysis temperrature on the extraction yield

2.1.5 酶解溫度對多糖得率的影響 由圖5可知，多糖得率隨著酶解溫度的增高而逐漸增大，50℃時，多糖得率達最大，而后，隨酶解溫度增高呈現(xiàn)下降。這是由于酶的活性與溫度有著密切的關(guān)系，每一種酶都有特定的最適溫度。若溫度繼續(xù)升高，酶在高溫下出現(xiàn)變性，酶活力逐漸下降，反應(yīng)速度降低，多糖得率下降[6]。

2.2 正交試驗設(shè)計

影響超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取的主要因素為pH、復(fù)合酶量、料液比、超聲波時間、酶解溫度，以多糖得率為考察指標，由單因素試驗初步篩選出5個單因素的取值范圍（見表1），利用L16(45)正交正交試驗，確定最佳提取工藝。

由表2、3可知，各因素對半枝蓮多糖得率的影響程度強弱為料液比>超聲時間>復(fù)合酶量>pH>酶解溫度。通過極差分析可知最優(yōu)工藝組合為A2B4C4D1E3，即pH 4.5，復(fù)合酶量0.025 g，料液比 1∶60(m∶V)，超聲時間 15 min，酶解溫度50℃，其中料液比對試驗的影響顯著。

2.3 最佳工藝的驗證實驗

表1 正交試驗因素水平表Table1 Orthogonal factor level table

表2 正交設(shè)計結(jié)果Table2 The resultof orthogonal design

按該工藝的最佳提取條件A2B4C4D1E3，進行5次驗證實驗，測得多糖的平均得率2.166%，優(yōu)于正交試驗中的任何一組，RSD為0.005%，說明提取工藝可行。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取樣品溶液2.0mL，按1.3.3中標準曲線法的操作方法于室溫條件下每隔20min測定1次吸光度值，重復(fù)做6次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此樣品溶液放置100min內(nèi)基本穩(wěn)定，相對標準偏差RSD=0.014%，結(jié)果見表4。

表3 方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance orthogonal design

表3 方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance orthogonal design

F0.10(3,3)=9.28，F(xiàn)0.01(3,3)=29.46。

偏差來源 自由度F值A(chǔ)BCDE離差平方和0.014 0.020 0.736 0.034 0.007 33333均方0.005 0.007 0.246 0.011 0.002 2.500 3.500 123.0 5.500顯著性不顯著不顯著顯著不顯著

表4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table4 Results of test stability

2.5 加樣回收率試驗

精密移取已知含量的半枝蓮粗多糖樣品溶液1 mL 6份，別置于6個25mL容量瓶中，分別加入葡萄糖標準溶液1mL，按方法1.3.3測定其吸光度，計算回收率。由表5可知，在A2B4C4D1E3條件下，樣品加樣平均回收率為90.918%，RSD為2.168%，說明此方法具有較好的加樣回收率。

3 結(jié)論

本試驗采用超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取，用正交試驗的方法對半枝蓮水溶性多糖的提取工藝進行了優(yōu)化研究，采用苯酚—硫酸法測定半枝蓮多糖的得率，結(jié)果表明，料液比對多糖得率的影響最大，其次是超聲時間，然后是復(fù)合酶量，再次是pH，酶解溫度影響最小。其最優(yōu)工藝組合為pH 4.5，復(fù)合酶量0.025 g，料液比為1∶60(m∶V)，超聲時間15min，酶解溫度50℃，該條件下多糖得率為2.166%，而且該提取工藝穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果Table5 Results of test recover

超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取半枝蓮多糖，超聲波能產(chǎn)生較大剪切力，再加上復(fù)合酶的酶解作用，從而使得半枝蓮細胞壁破裂，加速活性成分多糖的溶出，從而提高得率。該法具有條件溫和、節(jié)能、省時、操作簡單等優(yōu)點[7]，具有一定的推廣意義。

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