舒俊生 張尚明 陳開波 毛 健

SHU Jun-sheng1 ZHANG Shang-ming1 CHEN Kai-bo1 MAO Jian2

（1.安徽中煙工業(yè)有限公司技術(shù)中心，安徽 合肥 230088；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

（1.Research and Development Centre,China Tobacco Anhui Industrial Co.,LTD,Hefei,Anhui230088,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122,China)

在卷煙中應(yīng)用的許多香料具有較強的揮發(fā)性，且在抽吸過程中釋放不均勻。這些香料不但造成了卷煙生產(chǎn)的污染，還影響了卷煙產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。為了克服這些缺陷，開發(fā)非揮發(fā)性香料前體勢在必行。香料前體自身沒有香味，只有在高溫分解后才會生成大量香味成分。許多天然植物中糖苷、糖酯、Maillard反應(yīng)的中間體都是重要的天然香味前體[1-3]。1-L-脯氨酸-1-脫氧-D-果糖（1-L-proline-1-deoxy-D-fructose，PDF）是葡萄糖和脯氨酸Maillard初級反應(yīng)的中間體，是一種沒有香味的白色固體，在烤煙中含量較高[4]。其在高溫時熱解可以生成大量呋喃類、吡喃類、吡嗪類等多種香味成分，是理想的卷煙香料前體物[5]。有關(guān)1-L-脯氨酸-1-脫氧-D-果糖合成方法的文獻[6,7]較多，如保護法、固相合成法等，但關(guān)于其分離純化的研究較少。因此，本試驗采用沉淀法、納濾法和樹脂法對其進行分離純化，并對這些方法純化得到的PDF的純度進行比較，以確定PDF最佳的純化方法，為非揮發(fā)性香料前體的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

脯氨酸、葡萄糖：食品級，上海國藥集團；

無水乙醇、異丙醇、無水甲醇、乙酸乙酯、丙酮：分析純，上海國藥集團；

1-L-脯氨酸-1-脫氧-D-果糖：純度≥98%，凱氏（上海）科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-215型，瑞士Buchi公司；

超濾納濾儀：LNG-NF-101型，上海朗吉化工公司；

離子色譜儀：ICS3000型，美國Dionex公司；

超純水器：Milli-Q型，美國密理博公司；

納濾膜：M360型，截留分子量360 D，上海朗極化工科技有限公司；

陰離子交換樹脂：201×7、SQD56和D301型，安徽皖東樹脂有限公司；

陰離子交換樹脂：Dowex50WX8型，陶氏化學(xué)公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖、脯氨酸及PDF離子色譜法分析 色譜條件：陰離子交換柱：CarboPac PA-1；柱溫：30℃；淋洗液100 mM氫氧化鈉溶液和50 mM醋酸鈉溶液；流速：0.25 mL/min；進樣量：10 μL；檢測器：ED50；工作電極：金電極；參比電極：Ag/AgCl參比電極；分析時間：30min。

1.2.2 PDF的制備 稱取葡萄糖0.3mol、脯氨酸0.6mol置于圓底燒瓶中，加入700mL無水甲醇，水浴72℃下回流7 h。

1.2.3 PDF的純化 分別采用溶劑沉淀法、納濾法、離子交換樹脂層析法提純PDF。

(1)溶劑沉淀法：將1.2.2制備的甲醇反應(yīng)液濃縮至300mL，分別采用極性大小相近的有機溶劑丙酮、乙酸乙酯、異丙醇對目標(biāo)物進行沉淀。

(2)納濾法：將1.2.2得到的反應(yīng)液中的溶劑減壓蒸餾至干，加入1 L去離子水溶解。將此水溶液加入到納濾裝置的料液斗里，選用M360納濾膜進行分離。

(3)離子交換樹脂層析法：稱取20 g Dowex50WX8（100～200目）樹脂，使用0.5 mol/L HCl溶液活化0.5 h，濕法填柱，超純水沖洗層析住，直至流出液pH至中性。取1.2.2反應(yīng)液5 g減壓揮干，10mL超純水溶解，加入到層析柱進行分離，并收集含目標(biāo)組分的濾液。

稱取20 g D301樹脂，使用0.5mol/L HCl活化4 h；用去離子水沖洗至中性后，用0.5mol/LNaOH溶液浸泡4 h，用去離子水沖洗至中性。201×7及SQD56陰離子交換樹脂活化方法與D301樹脂相同。3種樹脂均采用濕法填柱。

1.2.4 PDF純度分析 采用1.2.1的方法進行離子色譜分析，測定出葡萄糖、脯氨酸和PDF含量，計算出PDF純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖、脯氨酸及PDF分析

糖類分子具有電化學(xué)活潑型及在強堿溶液中呈離子化狀態(tài)，Rocklin等[8]報導(dǎo)了采用離子交換色譜柱分離，脈沖安培檢測器測定糖的新方法。按照1.2.1色譜分離條件，對葡萄糖、脯氨酸和PDF進行了分離并繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，葡萄糖、脯氨酸、PDF 3種物質(zhì)得到良好的分離。葡萄糖、脯氨酸和PDF標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、0.999 9和1（圖2），為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 PDF不同提純方法比較

圖1 葡萄糖、脯氨酸、PDF離子色譜圖Figure 1 Ion chromatograph of glucose,proline and PDF

圖2 葡萄糖、脯氨酸和PDF的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curves of glucose,proline and PDF

2.2.1 溶劑沉淀法 不同的有機溶劑如丙酮、乙酸乙酯、異丙醇沉淀得到PDF的純度不同（表1），比較后發(fā)現(xiàn)，采用丙酮沉淀下來的PDF混合物極容易潮解變黃，且純度只有42%；采用乙酸乙酯沉淀得到的PDF純度也只有35%，PDF混合物在乙酸乙酯中的溶解度較高，使得PDF不能得到很好的純化；而采用異丙醇沉淀PDF比較理想，純度可達62%，能有效克服上面兩種沉淀溶劑的缺點。葡萄糖、脯氨酸和PDF在3種溶劑中都具有一定的溶解度，這可能是由于葡萄糖、脯氨酸和PDF都具有一定的極性，與不同溶劑間的作用力不同從而得到不同純度的PDF。

表1 溶劑對PDF純度的影響Table1 Effectof solvent on PDF purity /%

2.2.2 納濾法 納濾法的起始壓力為2 000 kPa，流量為18.2 L/h。本試驗研究了壓力和流量對PDF純度的影響。結(jié)果表明，流量為36.4 L/h，壓力2 500 kPa，PDF純度最高，可達92%（表2）。納濾法比溶劑沉淀法具有更高的選擇性，這可能是由于葡萄糖、脯氨酸和PDF 3種化合物的分子量（分別為180.16，115.13和277.29）差別較大，因此，納濾法比溶劑沉淀法選擇性較高。

2.2.3 離子交換樹脂層析法 制備PDF的反應(yīng)溶液中主要含有PDF、葡萄糖、脯氨酸，在水溶液狀態(tài)下，皆為帶負(fù)電荷陰離子極性化合物，可以采用陰離子交換樹脂進行分離純化。本試驗研究了4種陰離子交換樹脂對PDF純度的影響。201×7和Dowex50WX8為強陰離子型，而D301和SQD56為弱陰離子型。陰離子交換樹脂分離后，PDF的純度見表3。由表3可知，兩種強陰離子型交換樹脂對PDF的純化效果較好，純度高達 93%（201×7）和 97%（Dowex50WX8）。而兩種弱陰離子型樹脂D301和SQD56的效果較差，PDF的純度僅為78%（D301）和 80%(SQD56)?？赡苁且驗楦彼?pKa=1.99，葡萄糖pKa=12.28，PDF是二者縮合物，其pKa值介于二者之間，3種化合物pKa相差較大，因此強陰離子交換樹脂能夠?qū)@3種化合物具有較高分離度。

表2 納濾流量和壓力對PDF純度的影響Table2 Effectof nanofiltration flow and pressure on PDF purity /%

表3 不同離子樹脂對PDF純度的影響Table3 Effect of different ion resin on PDF purity /%

綜合比較以上3種分離純化方法，離子交換樹脂層析法優(yōu)于其他兩種方法，與要分離純化物質(zhì)的特性有關(guān)，脯氨酸、葡萄糖以及PDF的PKa相差較大，有利于使用強陰離子交換樹脂進行離子交換。

3 結(jié)論

近年來，關(guān)于PDF化學(xué)制備的方法較多，但缺乏對其分離純化的研究報道。因此，本試驗對PDF純化的方法進行了研究、比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)強陰離子交換樹脂可以較好的分離純化PDF，其純度達90%以上。這是因為PDF是帶負(fù)電荷的多羥基極性化合物，且離子交換樹脂具有離子交換和吸附的雙重作用，能對其進行有效的分離和純化[9]。這為非揮發(fā)性香料前體的開發(fā)提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)。

1 張正竹，宛曉春，陶冠軍.茶鮮葉中糖苷類香氣前體的液質(zhì)聯(lián)用分析[J].茶葉科學(xué)，2005，25(4)：275～281.

2 Lin Y,Wagner G J.Rapid and simplemethod for estimation of sugar esters[J].J.Agr.Food Chem.,1994,42(8):1 709～1 712.

3 Ames JM.Applications of themaillard reaction in the food industry[J].Food Chem.,1998,62(4):431～439.

4 楊金英，牟定榮，梅勇，等.HPLC-ELSD法測定煙草中的脯氨酸Amadori化合物[J].分析試驗室，2010，29(8)：97～100.

5 張敦鐵，殷發(fā)強，何佳文.三種Amadori化合物的熱解研究[J].中國煙草學(xué)報，2006(2)：13～16.

6 Blank I,Devaud S,Matthey-Doret W,et al.Formation of odorants in Maillard model systems based on L-proline as affected by pH[J].J.Agr.Food Chem.,2003,51(12):3 643～3 650.

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8 Rocklin D,Pohl C A.Determination of carbohydrate by anion exchange chromatography with pulse amperometric detection[J].Liquid Chrom,1983,6(9):1 577～1 590.

9 莫曉燕，詹谷宇，項昱紅.二磷酸果糖的純化研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2001，32(3)：100～101.