[摘要] 目的 研究雌二醇對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞白介素-10（IL-10）的表達(dá)調(diào)控作用及其相關(guān)機(jī)制，以期為臨床更好地防治相關(guān)炎性疾病提供新思路。方法 選用4周齡C57BL/6j雄性小鼠，體外培養(yǎng)骨髓巨噬細(xì)胞。收集細(xì)胞，用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測雌激素受體。將細(xì)胞與內(nèi)毒素孵育的同時(shí)，分別加入雌二醇，他莫昔芬及雌二醇，24h后收集培養(yǎng)液，用ELISA法檢測IL-10的含量，并提取細(xì)胞蛋白，用Western blotting法檢測各處理組核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）的激活情況。 結(jié)果 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測結(jié)果顯示小鼠骨髓巨噬細(xì)胞表達(dá)雌激素受體。ELISA檢測結(jié)果顯示內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-10，雌二醇本身對IL-10的表達(dá)無影響，卻可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-10表達(dá)，而此抑制作用被他莫昔芬拮抗。同時(shí)，Western blotting檢測到內(nèi)毒素激活細(xì)胞NF-κB通路，雌二醇抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NF-κB活化，而此抑制作用可被他莫昔芬拮抗。結(jié)論 雌二醇通過雌激素受體抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞IL-10的表達(dá)，此抑制作用與雌激素抑制內(nèi)毒素對細(xì)胞NF-κB通路的激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 雌激素；巨噬細(xì)胞；白介素-10；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

[中圖分類號] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）19-24-03

雌激素是機(jī)體重要的激素之一，不僅在雌性個(gè)體的發(fā)生、生長發(fā)育和生殖等方面起著至關(guān)重要的作用，還具有多種生物效應(yīng)，大量臨床及流行病學(xué)資料顯示，雌激素可調(diào)控炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，影響某些涉及炎性病理過程的疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸[1]。目前，性激素影響機(jī)體炎癥反應(yīng)的研究熱點(diǎn)集中在性激素對炎性細(xì)胞的調(diào)節(jié)上[2]。本

實(shí)驗(yàn)在體外分離培養(yǎng)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，用內(nèi)毒素激活巨噬細(xì)胞表達(dá)，研究雌二醇對巨噬細(xì)胞抗炎介質(zhì)白介素-10（interleukin-10，IL-10）的表達(dá)調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制，以期為臨床更好地防治相關(guān)炎性疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

4周齡雄性C57BL/6j小鼠，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子，IL-10 ELISA試劑盒購自美國RD公司；雌激素受體α抗體，雌激素受體β抗體，NF-κB （65kDa）抗體， 聚合酶PARP抗體，辣根過氧化物酶-二抗，異硫氰酸熒光素-二抗購自美國Santa Cruz公司。內(nèi)毒素，雌二醇，他莫昔芬購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 BMM的制備 選用4周齡雄性C57BL/6j小鼠[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（蘇）2007-0035]，頸椎脫臼處死。無菌條件下取雙側(cè)股骨，剪去骨兩端，用RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞，分散后培養(yǎng)于含巨噬細(xì)胞集落刺激因子（10ng/mL）及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。1d后，去除貼壁細(xì)胞，收集未貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL，置于含巨噬細(xì)胞集落刺激因子（10ng/mL）的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，5d后收集貼壁細(xì)胞備用。

1.2.2 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測雌激素受體的表達(dá) 取200μL細(xì)胞懸液，滴加于多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，0.5%多聚甲醛固定30min，避光分別于與雌激素受體α、β抗體孵育30min，磷酸鹽緩沖液漂洗玻片，異硫氰酸熒光素-二抗孵育30min，磷酸鹽緩沖液漂洗玻片，孵育完畢，用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測熒光分布狀況。

1.2.3 ELISA檢測細(xì)胞因子白介素-10的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)按不同處理因素分為空白對照組、內(nèi)毒素組（1μg/mL）、雌二醇組（1nM）、雌二醇+內(nèi)毒素組、他莫昔芬（10nM）+雌二醇+內(nèi)毒素組，24h后吸取培養(yǎng)上清用于細(xì)胞因子IL-10的測定。采用ELISA抗體夾心法，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 Western blotting分析NF-κB的活化 實(shí)驗(yàn)分組同上，處理因素作用24h后，提取細(xì)胞核蛋白用Western blotting法檢測NF-κB的活化。按每孔50μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（Millipore， MA，USA），將膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（10mM Tris，150mM NaCl，and 0.05% Tween 20）在室溫下封閉1h后，與特異性一抗（用TBST緩沖液按1︰2000稀釋）室溫下孵育2h，再與辣根過氧化物酶-二抗室溫孵育1h，然后將膜經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測，暗室曝光，膠片沖洗晾干后掃描蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌激素受體的檢測結(jié)果

多數(shù)骨髓巨噬細(xì)胞細(xì)胞呈梭形或星形，部分為圓形。將巨噬細(xì)胞分別與雌激素受體α、β抗體及異硫氰酸熒光素-二抗孵育后，用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測其與巨噬細(xì)胞的結(jié)合狀況。結(jié)果顯示，熒光物質(zhì)分布于細(xì)胞胞漿中，骨髓巨噬細(xì)胞表達(dá)雌激素α受體及β受體。見圖1。

2.2 細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)情況

ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比（152±18）pg/mL，內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)IL-10（956±72）pg/mL，雌二醇本身對細(xì)胞IL-10的表達(dá)無影響（166±21）pg/mL，卻可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-10表達(dá)（623±40）pg/mL，而此抑制作用被他莫昔芬拮抗（998±56）pg/mL。見圖2。

2.3 NF-κB的活化情況

Western blotting檢測結(jié)果顯示，在內(nèi)毒素的作用下，骨髓巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化，核內(nèi)NF-κB p65含量顯著增加，雌二醇本身對細(xì)胞NF-κB的活化無影響，卻可下調(diào)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NF-κB p65的增加，說明雌二醇可以抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞NF-κB信號途徑的激活，而此抑制作用可被他莫昔芬拮抗。見圖3。

3 討論

雌激素主要包括雌酮、雌二醇和雌三醇，其中以雌二醇的生理功能最強(qiáng)。雌激素是女性生殖系統(tǒng)生長發(fā)育所必需的類固醇激素，但必須指出的是， 雌激素也顯示出潛在的促炎作用，一些研究發(fā)現(xiàn)， 選擇性抑制雌激素β受體能夠抑制促炎癥反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄， 雌激素β受體選擇性抑制劑顯示具有抗炎作用[3]。目前，性激素影響機(jī)體炎癥反應(yīng)的研究熱點(diǎn)集中在性激素對炎性細(xì)胞的調(diào)節(jié)上[2]。炎癥啟動的特征是炎性細(xì)胞的激活，巨噬細(xì)胞作為一種重要的炎性細(xì)胞，靜止期時(shí)殺傷感染細(xì)胞的活性較弱，經(jīng)內(nèi)毒素等因子激活后，其表面受體的表達(dá)增強(qiáng)，可以將效應(yīng)物質(zhì)釋放到胞外，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4-5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞表達(dá)抗炎介質(zhì)IL-10，雌二醇本身對細(xì)胞IL-10的表達(dá)無影響，卻可抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL-10表達(dá)。IL-10 屬于細(xì)胞因子中的干擾素家族，目前發(fā)現(xiàn)IL-10能通過下調(diào)單核細(xì)胞表面主要組織相容性抗原Ⅱ的表達(dá)， 降低其抗原呈遞作用，調(diào)T 淋巴細(xì)胞活性，抑制炎性細(xì)胞的激活、遷移和粘附；同時(shí)，IL-10 也能抑制炎癥因子的合成與釋放。Rene等發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性與外源性IL-10 均能在轉(zhuǎn)錄水平強(qiáng)烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞集落刺激因的合成， 從而起到抗炎的作用。

傳統(tǒng)理論認(rèn)為類固醇激素對靶細(xì)胞的作用是由其細(xì)胞內(nèi)受體介導(dǎo)的，該受體屬于配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子超家族，在結(jié)構(gòu)上有很大的保守性，激素通過自由擴(kuò)散進(jìn)入胞漿并與相應(yīng)受體結(jié)合，活化的受體二聚體與激素反應(yīng)元件特異結(jié)合，啟動下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，繼而合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)[6-7]。我們用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測到，骨髓巨噬細(xì)胞內(nèi)存在雌激素α受體、β受體，而雌二醇抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞IL-10的表達(dá)可被雌激素受體阻斷劑他莫昔芬拮抗，因此，雌二醇的抑制作用是通過雌激素受體介導(dǎo)的。

NF-κB通路是內(nèi)毒素誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)的關(guān)鍵信號通路[8-9]。NF-κB在正常情況下以p65 /p50異源二聚體的形式存在于胞漿中，在各種因素刺激下，NF-κB迅速激活，p65亞基進(jìn)入核內(nèi)直接作用于轉(zhuǎn)錄元件而激活轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)節(jié)多個(gè)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素可以激活骨髓巨噬細(xì)胞的NF-κB信號分子，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白增多，而雌二醇可以減少巨噬細(xì)胞NF-κB p65入核，降低了NF-κB的活性。而此抑制作用可被雌激素受體阻斷劑他莫昔芬拮抗，說明雌二醇對NF-κB通路的抑制作用是雌激素受體介導(dǎo)的。

雌激素具有確切的促炎作用，本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，雌二醇可以增強(qiáng)內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)，雌二醇通過雌激素受體抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的骨髓巨噬細(xì)胞抗炎介質(zhì)IL-10的表達(dá)，其機(jī)制與雌激素抑制NF-κB途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活有關(guān)。但必須指出的是，雌激素也可限制炎癥反應(yīng)，影響某些涉及炎性病理過程疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。例如，雌激素限制中性粒細(xì)胞黏附分子及促炎介質(zhì)表達(dá)，可減輕受損冠脈局部炎癥反應(yīng)[10]；雌激素能影響單核細(xì)胞分化為成熟巨噬細(xì)胞，在炎癥階段下調(diào)蛋白激酶和細(xì)胞因子的表達(dá)，造成愈合障礙[11]；此外，雌激素對于肺部感染性疾患及創(chuàng)傷性休克具有保護(hù)作用[12-13]；臨床上，更年期婦女因雌激素水平下降容易出現(xiàn)多種炎癥的發(fā)生。

由于雌激素受體的分布以及信號調(diào)控方式復(fù)雜，進(jìn)一步深入研究闡明雌激素對炎癥過程的精確調(diào)節(jié)模式，對于避免雌激素引發(fā)的不良反應(yīng)以及增加雌激素的治療效果具有重要意義。并且，對IL-10 抗炎機(jī)制的了解， 也會為我們防治病原體感染， 探索更多自身炎癥性疾病的新的治療策略開辟更為廣闊的空間。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Straub RH. The complex role of estrogens in inflammation [J]. Endocr Rev，2007，28（5）：521-574.

[2] Calippe B，Douin-Echinard V，Delpy L，et al.17Beta-estradiol promotes TLR4-triggered proinflammatory mediator production through direct estrogen receptor alpha signaling in macrophages in vivo [J].J Immunol，2010，185（2）： 1169-1176.

[3] Cvoro A，Tatomer D，Tee MK，et al.Selective estrogen receptor-beta agonists repress transcription of proinflammatory genes [J].J Immunol，2008，180（1）：630-636.

[4] Naito M.Macrophage differentiation and function in health and disease[J]. Pathol Int，2008，58（3）：143-155.

[5] Nagamatsu T，Schust DJ.The immunomodulatory roles of macrophages at the maternal-fetal interface[J].Reprod Sci，2010，17（3）：209-218.

[6] Stossi F，Barnett DH，F(xiàn)rasor J，et al.Transcriptional profiling of estrogen-regulated gene expression via estrogen receptor （ER） alpha or ER beta in human osteosarcoma cells：distinct and common target genes for these receptors [J].Endocrinology，2004，145（7）：3473-3486.

[7] Favre J，Gao J，Henry JP，et al.Endothelial estrogen receptor α plays an essential role in the coronary and myocardial protective effects of estradiol in ischemia/reperfusion[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（12）：2562-2567.

[8] Edwards MR，Bartlett NW，Clarke D，et al.Targeting the NF-kappaB pathway in asthma and chronic obstructive pulmonary disease [J]. Pharmacol Ther，2009，121（1）：1-13.

[9] Wong ET，Tergaonkar V.Roles of NF-kappaB in health and disease： mechanisms and therapeutic potential[J]. Clin Sci，2009，116（6）：451-465.

[10] Miller AP，F(xiàn)eng W，Xing D，et al.Estrogen modulates inflammatory mediator expression and neutrophil chemotaxis in injured arteries[J].Circulation， 2004， 110（12）：1664-1669.

[11] Ashcroft GS， Mills SJ， Lei K， et al. Estrogen modulates cutaneous wound healing by downregulating macrophage migration inhibitory factor[J].J Clin Invest，2003，111（9）：1309-1318.

[12] Doucet DR，Bonitz RP，F(xiàn)einman R，et al. Estrogenic hormone modulation abrogates changes in red blood cell deformability and neutrophil activation in trauma hemorrhagic shock [J].J Trauma，2010，68（1）：35-41.

[13] Vegeto E，Cuzzocrea S，Crisafulli C，et al.Estrogen receptor-alpha as a drug target candidate for preventing lung inflammation [J]. Endocrinology，2010，151（1）：174-184.

（收稿日期：2013-07-24）

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31000630）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2010217）。