[摘要] 目的 觀察歸肺理氣方對(duì)痰熱壅肺證慢性阻塞性肺疾?。–OPD）大鼠血清與肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）的影響。 方法 將61只SD大鼠隨機(jī)分為7組（正常組、正常+中藥中劑量組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、潑尼松組），采用香煙熏吸加氣管內(nèi)注入脂多糖（LPS）法建立大鼠痰熱壅肺證COPD模型。予歸肺理氣方高、中、低3個(gè)濃度及強(qiáng)的松灌胃干預(yù)28d，檢測血清與肺組織MMP-9和TIMP-1含量。 結(jié)果 模型組大鼠血清與肺組織的MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值較正常組顯著增加（P<0.05），中藥中、高劑量組與潑尼松組的MMP-9量以及MMP-9/TIMP-1值較模型組顯著下降（P<0.05）。 結(jié)論 歸肺理氣方可調(diào)節(jié)痰熱壅肺證慢性阻塞性肺疾病大鼠的MMP-9/TIMP-1失衡，可能有一定的改善COPD氣道重塑作用。

[關(guān)鍵詞] 歸肺理氣；慢性阻塞性肺疾病；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）19-30-04

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其特點(diǎn)是氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展。確切的病因尚未完全闡明，但認(rèn)為與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD急性加重時(shí)患者出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、咳痰急性加重，病情變化大于每日自然病程變化程度，并且需要改變?nèi)粘Ｖ委煼桨竅1]。研究證據(jù)表明，在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上應(yīng)用中藥治療COPD急性加重期，可以顯著提高療效、明顯縮短病程、減少并發(fā)癥、改善肺通氣功能、降低致殘率等[2-3]。與西醫(yī)的治療手段相比，傳統(tǒng)中藥具有標(biāo)本兼治、雙向調(diào)節(jié)且毒副作用小的優(yōu)勢，為COPD急性加重期的治療帶來了新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 SD大鼠61只，雄性，體重（240±20）g，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（滬）2002-0010，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。將大鼠隨機(jī)分為7組（正常組、正常+中藥中劑量組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、潑尼松組）。

1.1.2 受試藥物 歸肺理氣方組成：魚腥草9g、黃芩9g、炙麻黃9g、杏仁6g、葶藶子6g、前胡6g、紫蘇6g、甘草6g。根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》[4]計(jì)算出中藥低、中、高劑量組的人鼠等效劑量分別為2.12、4.25、8.50g/kg，即分別為人體

臨床給藥劑量的0.5、1.0、2.0倍。按傳統(tǒng)工藝制備成水煎劑，減壓濃縮至0.212、0.425及0.850g/mL備用。潑尼松片（上海信誼藥業(yè)有限公司，批號(hào)：121106），研成粉末，加蒸餾水溶解，按6mg/kg灌胃。

1.1.3 儀器與試劑 動(dòng)物熏吸箱（60cm×50cm×40cm），自制；18號(hào)靜脈套管針（馬來西亞制造）；脂多糖（LPS，Sigma公司）；大前門牌香煙（上海煙草公司，烤煙型，焦油量12mg，煙氣煙堿量0.9mg，煙氣一氧化碳量14mg）。MMP-9試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120827），TIMP-1試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120823）。DK-S22電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；P20、P200、P1000吉爾森移液器，法國Gilson公司；Centrifuge 5417R型低溫高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 痰熱壅肺證COPD大鼠模型的制作 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]，采用氣管注脂多糖加熏香煙方法：在第1天和第14天，予1%的戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門，將18號(hào)靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1mL注射器注入溶于生理鹽水的LPS 200μL（1g/L），然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使LPS能夠均勻分布于兩肺。正常組注入生理鹽水。第2～28天（第14天除外）將大鼠置入60cm×50cm×40cm熏吸箱內(nèi)，注入大前門牌過濾嘴香煙煙霧，濃度約5%，每天上午、下午各1h。制作28d即為痰熱壅肺證COPD大鼠模型。正常組注入生理鹽水，不予熏煙。

1.2.2 給藥干預(yù)與取材 造模完成后第2天開始，正常組與模型組給予飲用水，中藥給藥組給予不同濃度的歸肺理氣方，潑尼松組予潑尼松片粉末溶液，連續(xù)給藥28d，在末次給藥后處理動(dòng)物。予3%戊巴比妥溶液麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，處死大鼠后取出左肺組織。

1.2.3 指標(biāo)測定 動(dòng)脈血經(jīng)5000r/min離心10min，分離出上層血清；稱取肺組織，按100mg組織配伍1mL生理鹽水的比例，加入生理鹽水，制備組織勻漿，經(jīng)5000r/min離心10min，取上清液檢測；采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清與肺組織中MMP-9和TIMP-1含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPAA15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)以（）表示，采用多組間單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1含量與MMP-9/TIMP-1值比較

正常+中藥中劑量組大鼠血清MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值較正常組無明顯改變（P>0.05），模型組大鼠血清MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值較正常組顯著增加（P<0.05），中藥中、高劑量組與潑尼松組的MMP-9含量以及MMP-9/TIMP-1值較模型組顯著下降（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1含量與MMP-9/TIMP-1值比較

正常+中藥中劑量組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值較正常組無明顯改變（P>0.05），模型組大鼠血清MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值較正常組顯著增加（P<0.05），中藥中劑量組的MMP-9含量以及MMP-9/TIMP-1值較模型組顯著下降（P<0.05），中藥高劑量組與潑尼松組的MMP-9和TIMP-1含量以及MMP-9/TIMP-1值較模型組顯著下降（P<0.05）。見表2。

3 討論

COPD發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚。國外研究認(rèn)為，COPD的發(fā)病機(jī)制可能包括3個(gè)方面：（1）氣道和肺部炎癥；（2）蛋白酶/抗蛋白酶失衡；（3）氧化/抗氧化失衡，并發(fā)現(xiàn)肺組織中彈性基質(zhì)成分的降解可能是COPD發(fā)生、發(fā)展的主要原因[6]。

目前肺泡壁細(xì)胞外彈性基質(zhì)破壞的詳細(xì)機(jī)制尚未明確，大量研究表明，蛋白酶活性增強(qiáng)以及蛋白酶/抗蛋白酶的失衡是其主要發(fā)病因素[7-8]。

MMPs及TIMPs是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解與合成的主要酶類，主要參與炎癥反應(yīng)和組織重建。MMPs是一類依賴于鋅離子和鈣離子，且高度保守的內(nèi)切蛋白酶水解家族，是細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中不可缺少的酶，幾乎能降解構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分[9]。MMPs在與支氣管哮喘、肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種肺部疾病及其他系統(tǒng)疾病（如膜性腎病、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等）關(guān)系密切[10]。

目前研究認(rèn)為在MMPs家族中，MMP-9是COPD急性加重期起主要作用的酶[11]。Vognola等[12]在COPD急性加重期患者的血清和肺活檢中均發(fā)現(xiàn)MMP-9的數(shù)量明顯高于正常人。MMPs的活性嚴(yán)格受到內(nèi)源性生理抑制物的調(diào)節(jié)，MMPs一經(jīng)激活，就可被一族內(nèi)源性金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）抑制。TIMPs是一個(gè)低分子量蛋白質(zhì)家族，其中TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用最廣，可以被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生[13]。TIMP-1是氣道重塑的重要因子，具有細(xì)胞生長因子樣作用，能使ECM沉積并抑制其降解，是氣道纖維化的標(biāo)志，它與MMP-9共同參與了慢性阻塞性肺疾病患者肺組織的進(jìn)行性破壞和相繼發(fā)生的氣道重塑過程[14]。

TIMP-1與MMP-9共分泌，機(jī)體正常時(shí)，與MMP-9呈1∶1結(jié)合，使ECM破壞及修復(fù)維持平衡。MMP-9/TIMP-1的平衡是維持ECM正常狀態(tài)所必須的，一旦平衡打破則出現(xiàn)病理狀態(tài)，MMP-9/TIMP-1比值升高，表明呼吸道以炎癥反應(yīng)為主，將引起組織破壞，MMP-9/TIMP-1比值下降，表面呼吸道以修復(fù)為主，過度降低（尤其是TIMP-1過度升高時(shí)）將出現(xiàn)纖維化可能[15]。

據(jù)報(bào)道，COPD急性加重期和COPD患者的痰中MMP-9/TIMP-1比值較健康人有顯著升高，提示此時(shí)的MMP-9增多更為明顯[16]。國外研究顯示，COPD急性加重期患者血清MMP-9、TIMP-1異常過度表達(dá)，表明ECM降解及合成均異?；钴S，TIMP-1在抑制MMP-9活性的同時(shí)，有引起纖維細(xì)胞增生及膠原合成增多和過度沉積的作用，從而導(dǎo)致ECM修復(fù)和重構(gòu)?？梢奙MP-9/TIMP-1失衡是氣道重塑并導(dǎo)致COPD急性加重的重要機(jī)制之一[17]。目前暫缺關(guān)于COPD急性加重期各中醫(yī)證型的MMP-9、TIMP-1表達(dá)情況研究成果[18]。

歸肺理氣方來源于《湯液本草》與《內(nèi)外傷辨惑論》，由魚腥草，黃芩、炙麻黃、杏仁、葶藶子、前胡、紫蘇、甘草組成。魚腥草味辛，微寒，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒，消癰排膿、利尿通淋功效?！侗静菥V目》謂：“散熱毒癰腫”；《本草經(jīng)疏》謂：“治痰熱壅肺，發(fā)為肺癰吐膿血之要藥”。紫蘇味辛、溫，歸肺、脾經(jīng)，具解表散寒功效。麻黃味辛、微苦，性溫，歸肺、膀胱經(jīng)，具發(fā)汗解表，宣肺平喘、利水消腫之功效。杏仁味苦，微溫，歸肺、大腸經(jīng)，具有止咳平喘，潤腸通便的作用。葶藶子性寒，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具清熱定驚，通絡(luò)，平喘，利尿之功效。前胡性苦、辛，微寒，歸肺經(jīng)，具有降氣化痰、疏散風(fēng)熱之功效。黃芩性苦、寒，歸肺、膽、脾、胃、大腸、小腸經(jīng)。具清熱燥濕，瀉火解毒功效。甘草性甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補(bǔ)脾益氣，祛痰止咳，緩急止痛，清熱解毒，調(diào)和諸藥作用。本方君藥魚腥草，具清熱化痰，降氣平喘功效。方中臣藥紫蘇、麻黃宣肺解表；同時(shí)配以杏仁、前胡化痰平喘。再佐以黃芩清泄肺中郁熱，葶藶子瀉肺中水氣、痰涎，利水消腫，甘草利氣以和中，止咳化痰，調(diào)和諸藥。全方配伍精密，針對(duì)痰熱壅肺證，共奏鎮(zhèn)咳祛痰、降氣平喘之功，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的整體觀念及辨證論治體系的充分體現(xiàn)。

本研究顯示，歸肺理氣方可調(diào)節(jié)痰熱壅肺證慢性阻塞性肺疾病大鼠的MMP-9/TIMP-1失衡，可能有一定的改善COPD氣道重塑作用，目前暫無中藥方劑COPD急性加重期對(duì)MMP-9及TIMP-1的作用的臨床報(bào)道，尤其對(duì)于按照COPD中醫(yī)辨證分型進(jìn)行中藥干預(yù)MMP-9/TIMP-1的臨床研究暫缺[19-21]。本研究可作為進(jìn)一步臨床研究的基礎(chǔ)，為痰熱壅肺證慢性阻塞性肺疾病的中西醫(yī)結(jié)合治療提供參考。

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（收稿日期：2013-06-17）