[摘要] 用光譜法研究了蛇床子素與脫氧核糖核酸的相互作用，結(jié)果表明，在最大發(fā)射波長(zhǎng)408 nm處，脫氧核糖核酸能顯著地猝滅蛇床子素的熒光信號(hào)。在pH=5.5時(shí)，信號(hào)猝滅的強(qiáng)度△F最大，并且體系的熒光強(qiáng)度與DNA濃度在10～40 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 蛇床子素；脫氧核糖核酸；相互作用

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）07-33-02

近年來(lái)，由于天然植物有效成分被廣泛應(yīng)用于生物制品、藥物等領(lǐng)域[1]，天然植物的活性成分與DNA的相互作用的研究受到了廣泛關(guān)注，蛇床子素與DNA結(jié)合作用研究還未見(jiàn)到。因此本文采用熒光光譜法，探討了蛇床子素與DNA的相互作用以及最佳條件，這些研究有助于了解蛇床子素在生物體內(nèi)復(fù)雜的相互作用過(guò)程，為提高其藥效和設(shè)計(jì)新藥提供參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

FLS 920熒光光譜儀（英國(guó)Edingburgh公司）；pHS-3B型精密酸度計(jì)（上海雷磁儀器）；BT25S電子分析天平（Sartorius公司）。

1.2 試劑

5.0×10-3 mol/L蛇床子素儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取1.22 mg蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110822-200407），用乙醇溶解并定容至1 mL，渦旋溶解即得。用時(shí)再用乙醇稀釋至所需濃度。

50 mmol/L MES緩沖液：稱取0.533 g MES，溶于40 mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5，最后加蒸餾水定容至50 mL即可。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化的超純水。

DNA序列：5’-CACGTCCATCTCTGCAGTCGGGTAGTTAAACCGACCTTCAGACATAGTGAGT-3’；DNA溶液的配制：按說(shuō)明書加適量緩沖稀釋成100 μmol/L的儲(chǔ)備液，用時(shí)再用緩沖稀釋至所需濃度，保存在4℃冰箱中備用。

1.3 熒光光譜的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1.0×10-3 mol/L的蛇床子素溶液10 μL于400 μL比色皿中，加入MES緩沖溶液適量（控制溶液總體積為200 μL），掃描其熒光光譜后，再分別加入一定體積的濃度為100 nmol/L的DNA溶液，混合均勻并靜置30 min，于340 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，408 nm為發(fā)射波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫都是3 nm條件下，測(cè)定熒光強(qiáng)度F值。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜特征

蛇床子素、DNA和蛇床子素-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射光譜分別如圖1和圖2所示。由發(fā)射光譜圖可以看出，DNA的熒光信號(hào)很弱，蛇床子素的熒光信號(hào)最強(qiáng)，當(dāng)加入DNA后，體系的熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱，可見(jiàn)DNA對(duì)蛇床子素的熒光具有猝滅作用。結(jié)果表明蛇床子素與DNA之間發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用。

.2 酸度與緩沖溶液的影響

考查了緩沖溶液的類型和pH值對(duì)熒光信號(hào)猝滅程度的影響。分別用Tris-HCl，PBS和MES 3種緩沖進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，在MES緩沖溶液中猝滅效果最為顯著，并且當(dāng)pH=5.5時(shí)加入DNA前后的△F達(dá)到最大值。因此選用pH=5.5的MES緩沖溶液作為本實(shí)驗(yàn)的最佳緩沖溶液。

2.3 離子強(qiáng)度與鹽效應(yīng)的影響

通過(guò)向體系中加入不同量的NaCl來(lái)考查離子強(qiáng)度和鹽效應(yīng)對(duì)體系的影響。當(dāng)NaCl的濃度在<10 mmol/L的情況下，體系的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯的影響。

2.4 DNA變性實(shí)驗(yàn)

將DNA在100℃的沸水中煮20 min后，立即拿出放入冰水中冷卻后，再將其加入蛇床子素的熒光體系中，發(fā)現(xiàn)此時(shí)熒光信號(hào)未降低，即變性后的DNA不能猝滅蛇床子素的熒光強(qiáng)度。

2.5 線性范圍

將蛇床子素的濃度固定為1.0×10-3 mol/L，取樣量為10 μL，改變DNA的濃度，分別測(cè)得熒光強(qiáng)度。熒光光譜如圖3所示。結(jié)果表明：在最佳條件下，體系的熒光強(qiáng)度與DNA的濃度在10～40 nmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。線性方程為：y=-798.99x+72 856，R2=0.9942，檢測(cè)限為1.2 nmol/L。

3 結(jié)論

蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚（Osthole），其化學(xué)名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高的一種烴基香豆素類有效化學(xué)成分[2]。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明蛇床子素具有抗高血脂[3]、抗心律失常[4]、抗衰老[5]、抗腫瘤[6-7]、抗骨質(zhì)疏松癥[8]、抗炎及抗變態(tài)反應(yīng)[9-11]等功效。周俊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素對(duì)肺鱗癌和肺腺癌的瘤體生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

脫氧核糖核酸（DNA）是人體內(nèi)一類重要的遺傳物質(zhì)，是抗腫瘤藥物作用的重要靶點(diǎn)之一。許多分子能與DNA分子發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響DNA的復(fù)制，因此研究小分子與DNA的作用，對(duì)于從分子水平上了解抗癌藥物作用機(jī)理以及以DNA為靶點(diǎn)的藥物分子設(shè)計(jì)具有重要意義[13-14]。

從本研究結(jié)果可以看出，蛇床子素與DNA之間有著較強(qiáng)的的相互作用，這種結(jié)合作用導(dǎo)致了體系熒光強(qiáng)度的猝滅，并且經(jīng)過(guò)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)這種猝滅的效果在pH=5.5的MES緩沖溶液中表現(xiàn)較為顯著，同時(shí)體系在鹽濃度<10 mmol/L的情況下影響不大；在最佳條件下，體系的熒光強(qiáng)度與DNA的濃度在10～40 nmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。但是具體是靜態(tài)猝滅還是動(dòng)態(tài)猝滅，以及這種相互作用的方式是吸附還是嵌入都還有待進(jìn)一步研究討論。

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（收稿日期：2013-03-19）