[摘要] 目的 探討Ki67、Survivin在早期宮頸癌組織中的表達(dá)，且與術(shù)后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系；分析Ki67和Survivin的相關(guān)性。 方法 收集110例手術(shù)切除或活檢標(biāo)本，包括正常宮頸組織，宮頸癌組織（按5年存活率及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組），進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測Ki67、Survivin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 宮頸癌組織中Ki67的表達(dá)率為85%，明顯高于正常宮頸組織，Ki67陽性表達(dá)與術(shù)后生存時間呈負(fù)相關(guān)（x2=5.7624，P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（x2=11.4820，P<0.01）；宮頸癌組織中Survivin表達(dá)率為80%，高于正常宮頸組織，Survivin陽性表達(dá)與術(shù)后生存時間呈負(fù)相關(guān)（x2=5.2410，P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（x2=10.0624，P<0.01）。 結(jié)論 Ki67、Survivin可作為反映宮頸癌預(yù)后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；Ki67；Survivin；生存時間；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）07-20-04

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，目前全球發(fā)病的年輕化趨勢越來越明顯，嚴(yán)重威脅女性健康。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們還發(fā)現(xiàn)了越來越多的與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)[1]，如凋亡途徑相關(guān)基因，細(xì)胞增殖相關(guān)基因，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因以及與生存相關(guān)的基因等。反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)很多，目前以Ki67最具代表性；近年來該因子用于各種惡性腫瘤生物學(xué)行為的研究Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，有研究表明Survivin的表達(dá)與腫瘤的惡性程度、預(yù)后不良呈正向關(guān)系，是一個有潛在價值的腫瘤標(biāo)志，與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。本實驗通過收集標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)法檢測Ki67、Survivin蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)，分析兩者在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討其與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系及兩者之間的相關(guān)性，為臨床防治宮頸癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

宮頸標(biāo)本取自2000年1月～2010年12月就診于山西省長治市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科且行手術(shù)切除的宮頸癌患者，選取80例為實驗組，其標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診為早期宮頸癌的宮頸新鮮備用標(biāo)本，其中存活率>5年有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組10例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組30例，存活率<5年有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組10例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組30例，患者年齡21～66歲，平均（45.2±14.3）歲。所有患者術(shù)前均未接受過放射治療、化學(xué)治療。正常對照組：隨機選擇同期在該院因子宮肌瘤等行子宮全切術(shù)經(jīng)病理證實宮頸正常的宮頸標(biāo)本30例。

1.2 主要試劑

鼠抗人Ki67單克隆抗體（即用型），兔抗人Survivin單克隆抗體（即用型），EDTA抗原修復(fù)液，SP免疫組化染色超敏試劑盒，DAB顯色劑，Ki-67、Survivin即用型S-P試劑盒，均有武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3 試驗方法

對所收集的正常宮頸組織、早期宮頸癌組織蠟塊作常規(guī)HE染色，采用SP法，嚴(yán)格按照購買試劑的說明書進(jìn)行操作，每個染色流程均設(shè)有對照以作為染色質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。具體步驟如下：（1）切片：水溫在40℃左右，4 μm貼于硅化的載玻片上。（2）烤片：60℃烤箱3 h以上。（3）脫蠟：常溫下3缸，二甲苯酸缸10 min依次過。（4）水化：由高濃度的酒精到低濃度酒精（95%酒精2 min→95%酒精2 min→70%酒精1 min→蒸餾水1 min→蒸餾水1 min）。（5）修復(fù)、洗修復(fù)液：將修復(fù)液放入高壓鍋內(nèi)，加熱至沸騰后，將石蠟切片放入鍋內(nèi)，不加閥開始噴氣計時5 min，關(guān)閉氣閥加壓10 min后，壓力鍋用冷水沖洗冷卻后，取出石蠟切片，用蒸餾水洗。（6）畫線：用專筆在組織周圍畫線。（7）上機：切片待畫線的線干后上架（PBS預(yù)洗→次→3%H2O2 10 min→PBS沖洗1次→一抗孵育60 min→PBS沖洗1次→二抗孵育15 min→PBS沖洗2次→DAB顯色4 min→蒸餾水沖洗2次）。（8）DAB顯色：取1 mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑各1滴，混勻后加至切片室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌，顯色時間主要取決于切片組織背景和陽性，控制背景顏色不宜太深，用水洗滌。（9）Mayor 蘇木素（#AR0005）輕度復(fù)染30 s左右，蒸餾水浸泡數(shù)分鐘后浸入飽和Na2HPO4溶液中2 min，取出后洗滌干燥。（10）干燥后的片子，第2天取出后用中性樹膠（#AR1018）封片，顯微鏡觀察。

1.4 結(jié)果判斷

Ki67染色以細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例分為：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性表達(dá)，≥10%為陽性表達(dá)；Survivin陽性染色主要位于胞漿和（或）胞核，以細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核出現(xiàn)黃色顆粒為陽性信號，采用雙盲法根據(jù)光鏡下隨機觀察切片5個視野，用半定量積分法判斷結(jié)果，陽性細(xì)胞所占百分比為0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。顯色強度黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕褐色為3分。細(xì)胞染色強度（等于陽性細(xì)胞積分、顯色強度積分）：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用x2檢驗及Fisher's精確概率法，兩指標(biāo)間比較采用二元變量的等級相關(guān)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織Ki67的表達(dá)

Ki67在宮頸癌組的陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組，在正常宮頸組的陽性表達(dá)率為6.7%，宮頸癌組為85%，兩組Ki67的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 不同宮頸組織Survivin的表達(dá)

Survivin在宮頸癌組的陽性表達(dá)率高于正常宮頸組，兩組Survivin的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 宮頸癌組織中Ki67與Survivin的表達(dá)與預(yù)后生存時間及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

在80例早期宮頸癌組織中存活率>5年的40例標(biāo)本中Ki67的陽性表達(dá)率為75%，Survivin的陽性表達(dá)率為70%；而存活率<5年的40例標(biāo)本中Ki67的陽性表達(dá)率為95%，Survivin的陽性表達(dá)率為90%。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本20例，Ki67陽性表達(dá)率為95%，Survivin陽性表達(dá)率為90%；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本60例，Ki67陽性表達(dá)率為82%，Survivin陽性表達(dá)率為77%。研究結(jié)果顯示，Ki67、Survivin的表達(dá)均與宮頸癌預(yù)后生存時間及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4 宮頸癌組織中Ki67和Survivin表達(dá)之間的相關(guān)性

在68例Ki67陽性的宮頸組織標(biāo)本中，有20例Survivin表達(dá)陽性，陽性率為29.41%，在12例Ki67陰性的宮頸癌組織標(biāo)本中，有5例Survivin表達(dá)陰性，7例Survivin表達(dá)陽性，陽性率為58.33%。兩者的表達(dá)是不相關(guān)的（r=0.182，P=0.258）。見表3。

3 討論

宮頸癌是全球發(fā)病率居第2位的婦女惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，在我國居女性惡性腫瘤之首，且有逐年遞增的趨勢。山西省襄垣縣、陽城縣是國內(nèi)外罕見的宮頸癌高發(fā)區(qū)，且發(fā)病人群有年輕化的趨勢，是嚴(yán)重威脅婦女健康的疾病之一。研究[2]發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌5年存活率為85.3%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年存活率為70.07%；導(dǎo)師前期研究[3-5]發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的5年存活率為87.4%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年存活率為49.7%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的5年存活率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了越來越多的與預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與抑癌基因的表達(dá)、調(diào)控，細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖有關(guān)。

3.1 宮頸癌與Ki67

反映腫瘤細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)很多，目前以核增殖抗原Ki67最具代表性；國內(nèi)外文獻(xiàn)報道[6]多種惡性腫瘤中均存在Ki67的過度表達(dá)。因此推測Ki67可能是一種癌基因[7]，過度表達(dá)可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；Ki67與惡性腫瘤的發(fā)生，轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，已廣泛用于研究腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后分析。Ki67抗原[8]屬于非組蛋白，是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原，因產(chǎn)生抗體的克隆生長在培養(yǎng)板67而得名。Ki67僅分布于細(xì)胞核內(nèi)[9]，高度增殖的細(xì)胞多與癌前病變組織及其惡性組織相關(guān)，增生、增殖常被認(rèn)為是生長紊亂的早期指標(biāo)。已有國內(nèi)外文獻(xiàn)報道[10]，Ki67可作為許多腫瘤的預(yù)后指標(biāo)，另有研究表明Ki67在早期宮頸癌進(jìn)展中有較強的預(yù)測作用。本研究通過收集早期宮頸癌蠟塊標(biāo)本，以正常宮頸組織切片為對照，采用免疫組織化學(xué)法對Ki67進(jìn)行測定，探討Ki67與宮頸癌預(yù)后生存時間及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)一步證實Ki67表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的相關(guān)性。

3.2 宮頸癌與Survivin

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，可以通過3種途徑[11]抑制細(xì)胞調(diào)亡：（1）通過內(nèi)源性和外源性途徑抑制細(xì)胞調(diào)亡；（2）參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)節(jié)和胞質(zhì)分裂；（3）促進(jìn)血管的形成。Survivin在癌組織中過度表達(dá)克服凋亡檢測點，通過有絲分裂促進(jìn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的異常增殖；在大多數(shù)人類常見腫瘤如肺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，前列腺癌，乳腺癌，胃癌等中表達(dá)異常升高；其表達(dá)往往與腫瘤的惡性程度、預(yù)后不良呈正向關(guān)系，是一個有潛在價值的腫瘤標(biāo)志，與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。Kim等[12]對不同宮頸組織中Survivin的表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，其在Ⅰ級CIN中的表達(dá)率為66.7%，在Ⅱ～Ⅲ級CIN中表達(dá)率為87.5%，在宮頸鱗狀上皮癌組織中表達(dá)率為100%。研究認(rèn)為，Survivin的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)展密切相關(guān)。Yoshida 等[13]研究顯示Survivin表達(dá)上調(diào)預(yù)示生存期短和預(yù)后不良。而Lee等[14]研究卻顯示Survivin的表達(dá)和生存率之間無關(guān)聯(lián)性。Survivin是否可以成為宮頸癌的一個新的預(yù)測指標(biāo)尚有爭議[15-16]。本試驗通過收集標(biāo)本，利用SP法對早期宮頸癌組織標(biāo)本及正常宮頸組織標(biāo)本Survivin的測定，分析其與預(yù)后生存期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)一步探討及證實Survivin高表達(dá)與早期宮頸癌預(yù)后的相關(guān)性，并得出結(jié)論。

本課題立足山西省這一宮頸癌高發(fā)區(qū)，首先對2000年1月～2010年12月就診于長治市醫(yī)院的早期宮頸癌患者進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，分析其生存時間。在此基礎(chǔ)上聯(lián)合檢測Ki67與Survivin基因，其分別在早期宮頸癌組織中高表達(dá)，驗證了Ki67、Survivin基因在早期宮頸癌中的表達(dá)情況，以及均與宮頸癌患者術(shù)后生存時間呈負(fù)相關(guān)、與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。同時分析Ki67、Survivin兩種蛋白表達(dá)在早期宮頸癌中的相關(guān)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩者無明顯相關(guān)性，通過聯(lián)合檢測Ki67和Survivin表達(dá)與宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩種基因聯(lián)合與宮頸癌臨床病理特征、術(shù)后生存的關(guān)系，有望為術(shù)后有效評估患者預(yù)后，指導(dǎo)術(shù)后輔助干預(yù)提供理論依據(jù)，也為下一步進(jìn)行二者表達(dá)與宮頸癌發(fā)病機制的研究及尋求新的治療宮頸癌靶點提供理論依據(jù)[17-18]。

[參考文獻(xiàn)]

[l] Baak JP，Kruse AJ，Janssen E，et al.Predictive testing of early CIN behviour by molecular biomarkers[J].CellOncol，2005，27（5-6）：277-280.

[2] Jakob C，LiersehT，Meyer W，et al.Predictive value of Ki67 and P53 in locally advaneed rectal cancer：correlation with thymidylate synthase and histopatho1ogieal tumor regression after neoadjuvants 5-FU-based chemoraio the rapy[J].World J Gastroenterol，2008，14（7）：1060-1066.

[3] 吳素慧，張靜，李穎，等.ETV5與MMP-7在早期宮頸癌組織中的表達(dá)及其在轉(zhuǎn)移中的作用[J].癌癥，2006（3）：19-23.

[4] 吳素慧，張靜，李穎，等.子宮頸癌Ib和IIa期患者預(yù)后相關(guān)因素的分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2007（2）：35-38.

[5] 吳素慧，趙燁，郝秋芳.MMP-2及TIMP-2在宮頸病變中的表達(dá)及意義[J].腫瘤研究與臨床，2003（5）：29-33.

[6] Poldowski W，Vanl Anschot JJ，Ten Kate FJ，et al.The value of P53 and Ki67 as markers for tumor progression in the Barretts dysplasia carcinoma sepuence [J].SurgOncol，1995，4：163-171.

[7] 晃紅霞，孫建衡，陸士新.bax基因在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達(dá)及意義[J].中華腫瘤雜志，2001，23（3）：214-216.

[8] Alalneda F，Mancebo G，Garcia MP，et al.A study of Ki67，cerB2-and cyclin D-1 expression in CIN-I，CIN-Ⅲ and squamous cell carcinoma of the cervix[J].Histol Histopathol，2007，22（6）：587-592.

[9] Arould Jan Kruse，Jan P.A.BaaK，Emiel A.Janssen，et al.Ki67 Predicts Progression in Early CIN：Validation of a multivariate Progression-risk model[J].Cellular Oneology，2004，26（1-2）：13-20.

[10] MMNai，RT Yin，C Xie，et al.The expression of RhoC and Ki67 in cervical intrae Pithelial Neoplasia and squamous careinoma of cervix[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2009，40（2）：236-239.

[11] 李英偉.Survivin在宮頸癌中的研究進(jìn)展 疾病監(jiān)測與控制雜志[J].2010，4（3）：89-92.

[12] Kim HS，ShirakiK，Park SH.Expression of survivinin CIN and invasives quamouseell carcinoma futerine CerV[J].Antieaneer Res，2002，22：805-808.

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