[摘要] 目的 檢測SLIT2與CXCR4在乳腺癌中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討SLIT2與CXCR4之間關(guān)系。 方法 應(yīng)用免疫組化法檢測217例浸潤性乳腺癌和20例正常乳腺組織標(biāo)本中SLIT2和CXCR4蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果SLIT2在正常乳腺組織表達(dá)高于乳腺癌，SLIT2與ER、PR表達(dá)呈正相關(guān)；CXCR4在乳腺癌中高表達(dá)，與HER2表達(dá)呈正相關(guān)，SLIT2與CXCR4 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論 SLIT2和CXCR4蛋白與浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性，檢測二者的表達(dá)對浸潤性乳腺癌治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；SLIT2；CXCR4

[中圖分類號] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）07-143-03

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升并呈現(xiàn)低齡化趨勢，對女性健康構(gòu)成了極大威脅[1]，從20世紀(jì)90年代起，中國發(fā)達(dá)地區(qū)乳腺癌發(fā)病率呈上升狀態(tài)，并逐步升至女性惡性腫瘤的首位。尋找乳腺癌新的生物學(xué)指標(biāo)一直是人們的研究熱點(diǎn)。SLIT是一種由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在體內(nèi)對神經(jīng)元軸突的生長進(jìn)行導(dǎo)向，在體外與感覺軸突側(cè)支發(fā)芽和生長有關(guān)。哺乳動物體內(nèi)的SLIT包含3種亞型即SLIT1、SLIT2、SLIT3 ，SLIT1主要神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，而后二者除神經(jīng)系統(tǒng)外，在人體內(nèi)多種組織都有所表達(dá)[2]。CXCR4 是一個編碼352個氨基酸的 G蛋白偶聯(lián)受體，與趨化因子 CXCL12（SDF-1） 相互作用，構(gòu)成了CXCR4/SDF1生物學(xué)軸介導(dǎo)細(xì)胞遷移與信息傳遞。目前SLIT2與CXCR4蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況了解甚少，其與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系也尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法檢測SLIT2、CXCR4在乳腺癌、乳腺正常組織表達(dá)情況，進(jìn)而探討分析其與腫瘤發(fā)生發(fā)展及臨床病理特征間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

237例乳腺組織取自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院，為2001～2009年手術(shù)切除標(biāo)本，其中乳腺正常組織20例，乳腺浸潤性癌病變組織217例。乳腺浸潤性癌按照ER（+）PR（+）、ER（-）PR（-）和HER2的陰陽性分為4組。

1.2 試劑

兔抗人單克隆anti-SLIT2抗體（武漢博士德公司），兔抗人CXCR4多克隆抗體（ab2074）購自abcam公司，PV9000二步法免疫組化檢測試劑及DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)PV-9000兩步法。4 μm連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟至水后。將切片浸入沸騰后pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)后，自然冷卻，PBS液沖洗2 min×3次。置于3% H2O2內(nèi)15 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS液沖洗2 min×3次。滴加一抗（SLIT2及CXCR4稀釋比例均為1︰100），4℃冰箱過夜；PBS液沖洗2 min×3次，滴加PV-9000二步法檢測試劑盒的試劑1，37℃溫箱內(nèi)孵育25 min；PBS液沖洗2 min×3次，滴加PV-9000二步法檢測試劑盒的試劑2，37℃溫箱內(nèi)孵育30 min；PBS液沖洗3 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。每批均設(shè)已知陽性切片作對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

SLIT2蛋白主要定位于胞漿，CXCR4蛋白定位于胞核和（或）胞漿，均以出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒為準(zhǔn)。對每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野，按染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色3分；按陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比評分：陰性為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；

最后按兩者乘積分?jǐn)?shù)評分，分?jǐn)?shù)≥3為陽性，<3分為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組間率的比較使用x2 檢驗(yàn)或校正的x2 檢驗(yàn)，SLIT2與CXCR4蛋白的相關(guān)性分析用非參數(shù)Spearman等級相關(guān)分析法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLIT2和CXCR4蛋白在浸潤性乳腺癌及乳腺正常組織中的表達(dá) （表1）

2.2 SLIT2 和CXCR4 蛋白表達(dá)與浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

SLIT2在正常乳腺組織表達(dá)（70.0%）高于乳腺癌（28.57%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。SLIT2表達(dá)在ER（+） PR（+）組高于ER（- ）PR（-）組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。SLIT2與ER、 PR表達(dá)呈正相關(guān)。SLIT2與HER2表達(dá)無相關(guān)性（P>0.05）（表3）。ER（-）PR（-） 組內(nèi)及ER（+）PR（+）組內(nèi)，SLIT2表達(dá)在HER2（-）組均高于HER2（+）組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4～5。CXCR4在乳腺癌中表達(dá)（67.74%）高于正常乳腺組織表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。ER（-）PR（-）組中的CXCR4表達(dá)（70.47%）高于ER（+）PR（+）組（65.17%），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P>0.05）。見表2。在總HER2（+）組的CXCR4表達(dá)高于總HER2（-）組，且在ER（-）PR（-）組內(nèi)及在ER（+）PR（+）組內(nèi)，HER2（+）組中CXCR4的表達(dá)均高于HER2（-）組中的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CXCR4與HER2正相關(guān)（P<0.05）。見表3～5。

2.3 SLIT2和CXCR4蛋白在浸潤性乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

在乳腺癌組中62例SLIT2蛋白表達(dá)陽性病例中，21例CXCR4蛋白表達(dá)陽性，155例SLIT2蛋白陰性病例中，29例CXCR4表達(dá)陰性。經(jīng)Sperman相關(guān)分析顯示，乳腺癌中SLIT2與CXCR4 蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r =-0.458，P<0.01） 。

乳腺癌組中CXCR4核及漿表達(dá)，乳腺癌組中SLIT2漿表達(dá)見圖1～2。

3 討論

Slits 基因編碼一組相對分子質(zhì)量為（170～190）×103 的分泌型蛋白質(zhì)， 目前克隆的有Slit1、Slit2以及SLIT3。SLIT2是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的腫瘤抑制因子，該基因位于位于4P15.2。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因有抑瘤活性。該蛋白在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，如肺癌[3]，膠質(zhì)瘤[4]等。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化方法檢測SLIT2蛋白在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SLIT2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)水平低于正常乳腺組織，提示該蛋白表達(dá)缺失可能和乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。并且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Slit2與ER、PR表達(dá)呈正相關(guān)，提示Slit2可能與乳腺癌發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。Kim等[5]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中SLIT2基因甲基化頻率明顯高于正常乳腺組織，提示腫瘤組織中SLIT2基因發(fā)生甲基化從而使其表達(dá)降低。

CXCR4 基因位于染色體2q21，編碼蛋白質(zhì)含352個氨基酸，主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并與趨化因子 CXCL12（SDF-1） 相互作用， 構(gòu)成了CXCR4/SDF1生物學(xué)軸介導(dǎo)細(xì)胞遷移與信息傳遞。該基因編碼的蛋白質(zhì)在人體組織中廣泛存在，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，如膽囊癌[6]，結(jié)腸癌[7]等。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CXCR4基因所編碼的蛋白在乳腺癌組織的中的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織，且與HER2表達(dá)正相關(guān)，提示CXCR4的高表達(dá)是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的促進(jìn)因素。Muller等[8]研究表明，乳腺腫瘤細(xì)胞較正常乳腺細(xì)胞的CXCR4表達(dá)明顯增高，推測乳腺腫瘤細(xì)胞中的CXCR4與其相應(yīng)的配體結(jié)合后可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞癌變，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞趨化和侵襲。

SLIT2作為一種有效的化學(xué)誘導(dǎo)物，參與調(diào)解Slit/Robo信號通路；此外，SLIT也可通過影響CXCR4所介導(dǎo)的信號通路的下游分子，進(jìn)而調(diào)解CXCR4的表達(dá)[9]。Marlow等[10]研究發(fā)現(xiàn)，SLIT的過表達(dá)可以使CXCR4表達(dá)水平降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果乳腺癌組織中SLIT2與CXCR4蛋白的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，提示兩者共同參與了乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程。因此，進(jìn)一步探索Slit2和CXCR4在乳腺癌細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)機(jī)制，將有望為乳腺癌靶向治療提供新的思路與策略。

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（收稿日期：2013-03-11）