[摘要] 目的 觀察脂氧素A4 （LXA4）對(duì)大鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用。 方法 使用D-氨基半乳糖（D-GalN）+脂多糖（LPS）建立大鼠急性肝衰竭動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)分為6組：正常組、模型組、LXA4 小、中、大劑量組、四氫化吡咯二硫代氨基甲酸酯（PDTC）組。檢測(cè)肝臟炎癥變化、炎性細(xì)胞因子水平、凋亡指標(biāo)等表達(dá)。 結(jié)果 大鼠急性肝衰竭時(shí)，肝臟轉(zhuǎn)氨酶明顯升高，肝組織炎癥壞死明顯，組織學(xué)評(píng)分明顯升高，血清IL-6及TNF-α及肝組織TNF-α mRNA及IL-6 mRNA水平明顯升高；脂氧素組及PDTC組肝臟轉(zhuǎn)氨酶明顯下降，組織學(xué)改變均明顯好轉(zhuǎn)；脂氧素大劑量組與PDTC組比較，上述大部分指標(biāo)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 LXA4 對(duì)大鼠急性肝衰竭有保護(hù)作用，可減少致炎性細(xì)胞因子的分泌。

[關(guān)鍵詞] 脂氧素A4；急性肝衰竭

[中圖分類號(hào)] R575.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）07-38-03

脂氧素是1984年由Serhan發(fā)現(xiàn)的一類花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，其包括脂氧素A4和脂氧素B4，在炎癥等病理過(guò)程中發(fā)揮廣泛的抗炎促消退作用。脂氧素A4是體內(nèi)重要的內(nèi)源性促炎癥消退介質(zhì)，是炎癥反應(yīng)的重要“剎車信號(hào)”[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)LXA4在急性肝衰竭中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道，鑒于LXA4在炎癥中的特殊作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。使用D氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合脂多糖（LPS）對(duì)大鼠腹腔注射建立急性肝衰竭模型，觀察LXA4對(duì)大鼠急性肝衰竭的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

LXA4購(gòu)自Cayman，D-氨基半乳糖（D-GalN）購(gòu)自Biosharp，Percoll分離液購(gòu)自武漢谷歌生物，IV型膠原酶購(gòu)自Biosharp，其余試劑無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma。

1.2 建立動(dòng)物模型

雄性SPF級(jí)Wister大鼠33只，體重在170～230 g之間，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，編號(hào)syxk（鄂）2003-0014。所有大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、脂氧素組小、中、大劑量組、PDTC組共6組。正常組3只，其余各組均為6只，分別用

苦味酸溶液做好標(biāo)記。模型組先給大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖300 mg/kg，半小時(shí)后在不同部位腹腔注射脂多糖50μg/kg；脂氧素小、中、大劑量組先分別給大鼠腹腔注射脂氧素A4 0.5、1、2μg/kg，半小時(shí)后在不同部位腹腔注射D-氨基半乳糖300 mg/kg和脂多糖50μg/kg；PDTC組大鼠先腹腔注射PDTC 100 mg/kg及D-氨基半乳糖，半小時(shí)后腹腔注射D-氨基半乳糖300 mg/kg和脂多糖50μg/kg。所有大鼠均在給藥處理24 h后處死。

1.3 肝組織病理檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、制成切片后采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟的病理?yè)p傷情況。采用400倍鏡頭觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野。結(jié)果判定：0級(jí)，無(wú)或僅有少許損傷；1級(jí)，輕度損傷，細(xì)胞腫脹，局限細(xì)胞出現(xiàn)核固縮；2級(jí)，中度損傷，廣泛核固縮，胞漿嗜酸性染色增強(qiáng)，出現(xiàn)橋接壞死；3級(jí)，嚴(yán)重壞死，肝索消失，出血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.4 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

ALT，AST活性檢測(cè)，血清分離后立即在自動(dòng)生化儀上檢測(cè)。血清TNF-α及IL-6檢測(cè)，血清TNF-α及IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自RD公司，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。肝組織TNF-αmRNA及IL-6 mRNA檢測(cè)，采用Realtime-PCR，實(shí)時(shí)PCR所用試

劑為SYBR qPCR mix（TOYOBO）。

1.5 肝組織Caspase3活性檢測(cè)

應(yīng)用商品化試劑盒（碧云天），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，所有計(jì)量資料均以（）表示，組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能情況

模型組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）均明顯升高，脂氧素小中大劑量組ALT、AST均較模型組降低（P<0.05）。PDTC組ALT、AST的升高程度與脂氧素大劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

注：與正常組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05，與PDTC組比較，▲P<0.05VT

2.2 各組大鼠肝臟病理切片情況

模型組大鼠的肝細(xì)胞變性壞死和匯管區(qū)炎癥明顯（圖1），脂氧素小中大劑量組和PDTC組大鼠的肝細(xì)胞變性及壞死較模型組明顯減輕（P<0.05），PDTC組肝臟炎癥評(píng)分與脂氧素大劑量組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠血清IL-6、TNF-a情況

模型組大鼠的IL-6、TNF-a水平較正常組明顯升高，脂

氧素小中大劑量組和PDTC組大鼠的IL-6、TNF-a水平較模型組明顯下降（P<0.05）。PDTC組大鼠的IL-6、TNF-a水平與脂氧素大劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 肝組織TNF-αmRNA及IL-6mRNA表達(dá)（RealTime-PCR）

模型組大鼠肝組織TNF-α mRNA及IL-6mRNA表達(dá)明顯升高，與正常組相比，P<0.05。脂氧素各組與PDTC組大鼠肝組織TNF-α mRNA及IL-6mRNA表達(dá)量較模型組明顯下降（P<0.05）。脂氧素大劑量組與PDTC相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.5 各組大鼠肝組織Caspase3活性檢測(cè)結(jié)果

模型組大鼠肝組織Caspase3活性明顯升高，與正常組相比，P<0.05。脂氧素各組與PDTC組大鼠肝組織Caspase3活性較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。脂氧素大劑量組與PDTC相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

D-氨基半乳糖和脂多糖聯(lián)合使用能夠造成特異性的肝損傷，在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常被用來(lái)制作急性肝衰竭動(dòng)物模型[2]。在此次實(shí)驗(yàn)中急性肝衰竭模型大鼠顯示肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性明顯

增高，AST超過(guò)8000 U/L，肝臟病理檢查發(fā)現(xiàn)肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，存在嚴(yán)重的炎癥壞死及出血，且模型組大鼠死亡率達(dá)到50%，說(shuō)明我們?cè)炷Ｊ浅晒Φ摹?/p>

本研究中發(fā)現(xiàn)給予大鼠注射脂氧素A4能明顯減輕D-氨基半乳糖和脂多糖聯(lián)合造成的急性肝損傷，肝功能上可以降低大鼠血清ALT、AST水平，組織學(xué)上表現(xiàn)為能夠明顯降低肝組織的炎癥壞死，提高存活率。證實(shí)了LXA4具有保護(hù)肝組織的作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，TNF-α的誘導(dǎo)作用是已知的肝臟炎癥反應(yīng)中最早起作用的因素之一，它可以引發(fā)其他細(xì)胞因子的循環(huán)炎級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得肝細(xì)胞壞死和觸發(fā)炎癥消退反應(yīng)[3]。在不同的微環(huán)境下TNF-α能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖同時(shí)也可以促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡或壞死[2]。TNF-α通過(guò)激活肝細(xì)胞的NF-κB來(lái)抗凋亡，通過(guò)活化caspases來(lái)促進(jìn)凋亡或壞死[4]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，急慢性乙肝患者和丙肝患者的血清及肝組織中TNF-α水平都較正常人有升高，急性肝衰竭患者血清中TNF-α含量升高非常明顯[5]。TNFR1缺失的小鼠能夠完全抵御D-氨基半乳糖和脂多糖聯(lián)合給藥造成的致死性肝損傷，說(shuō)明TNF在此模型中起到核心作用[6]。在本研究中，脂氧素能夠明顯降低急性肝衰竭時(shí)血清TNF-α及肝組織TNF-αmRNA水平，證實(shí)其保肝作用與此有關(guān)。

在肝臟，Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌IL-6[7]，在肝臟發(fā)生急性炎癥時(shí)可以誘導(dǎo)肝臟生成急性期蛋白，急性期蛋白在急性肝炎患者血清中的含量和患者疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[8]。如果阻斷小鼠肝細(xì)胞IL-6的信號(hào)通路，IL-6對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肝衰竭敏感性增加[9]。本研究顯示脂氧素能夠明顯減少急性肝衰竭時(shí)血清中IL-6及肝組織IL-6 mRNA水平。在肝臟內(nèi)TNF-α及IL-6主要是由Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生[10]。特異性的抑制Kupffer細(xì)胞NF-κB激活可以阻斷脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生，進(jìn)而抑制肝細(xì)胞的死亡。最近的文獻(xiàn)也報(bào)道，抑制Kupffer細(xì)胞NF-κB活化能夠減少致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，能夠改善D-GlaN/LPS誘導(dǎo)肝衰竭大鼠肝損傷并提高存活率，并且對(duì)肝組織中的抗凋亡蛋白沒(méi)有影響[11]。既然如此，那么脂氧素對(duì)肝臟的保護(hù)作用是否是通過(guò)抑制Kupffer細(xì)胞NF-κB的活性來(lái)發(fā)揮作用呢？需要我們更深入的研究。

有文獻(xiàn)報(bào)道PDTC處理可以顯著保護(hù)硫代乙酰胺引起的急性肝衰竭[12]。本研究顯示，脂氧素對(duì)急性肝衰竭大鼠的保護(hù)作用優(yōu)于PDTC，提示脂氧素對(duì)肝衰竭的保護(hù)作用還存在其他的保護(hù)途徑。LXA4能夠降低D-GlaN/LPS誘導(dǎo)肝衰竭大鼠血清中的TNF-α和IL-6水平，減輕肝細(xì)胞的凋亡和壞死經(jīng)過(guò)LXA4預(yù)處理的大鼠各項(xiàng)指標(biāo)優(yōu)于PDTC組，說(shuō)明LXA4對(duì)急性肝衰竭大鼠的保護(hù)作用是通過(guò)多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。具體的保護(hù)機(jī)制需要進(jìn)一步更完善的研究來(lái)揭示，這也是我們今后的工作目標(biāo)。

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（收稿日期：2013-03-04）