作者簡介：鄭永仁（1965～），男，云南楚雄人，實驗師，主要從事實驗動物和動物實驗工作；

通信作者：楊和金（19725～），男，云南省牟定人，高級工程師，主要從事新藥開發(fā)，藥理研究，動物疾病模型研究以及物實驗動物管理等方面工作，郵箱：yanghejindayuan@siancom

摘要：目的：研究云南習(xí)用骨碎補老鷹翅膀?qū)φ殉菜麓笫蠊琴|(zhì)疏松的治療作用。方法：雌性SD大鼠，除正?？瞻捉M（假手術(shù)組）外、其余大鼠去卵巢造成大鼠骨質(zhì)疏松模型，隨機分為模型組、陽性組（雌二醇組）及老鷹翅膀低、中、高劑量組，每組12只大鼠，觀察給予老鷹翅膀治療60 d后大鼠骨質(zhì)量、骨密度、骨組織形態(tài)計量學(xué)及血漿中磷、鈣、堿性磷酸酶（ALP）及骨生物力學(xué)指標(biāo)的變化。結(jié)果：與空白組比較，模型組的大鼠骨密度、骨質(zhì)量均有不同程度的降低，血漿中ALP顯著升高，Ca含量降低，骨生物力學(xué)指標(biāo)顯著降低，骨小梁數(shù)量減少，骨皮質(zhì)厚度變薄，成骨細(xì)胞數(shù)顯著降低，破骨細(xì)胞數(shù)顯著升高，與模型組比較，陽性藥組及經(jīng)老鷹翅膀治療60d后的三劑量組，摘除卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度、骨質(zhì)量均有不同程度的升高，骨組織形態(tài)計量學(xué)參數(shù)變化均有顯著性差異，血漿中ALP顯著降低，Ca、P含量升高，骨生物力學(xué)各指標(biāo)顯著升高，骨小梁數(shù)量增加，骨皮質(zhì)厚度變厚，成骨細(xì)胞數(shù)顯著增加，破骨細(xì)胞數(shù)顯著降低。結(jié)論：老鷹翅膀?qū)φ殉苍斐傻拇笫蠊琴|(zhì)疏松有一定的防治作用。

關(guān)鍵詞：骨質(zhì)疏松；去卵巢大鼠；骨碎補；模型

中圖分類號：R2856

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-2349（2013）07-0057-03

骨質(zhì)疏松（Osteoporosis OP）是一種全身代謝性骨骼疾病，主要特征表現(xiàn)為全身骨量減少和骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化，引起骨脆性增加和骨密度降低，骨折危險性增加[1]。隨著中國人口老齡化問題日趨嚴(yán)重，老年性骨質(zhì)疏松癥患者愈來愈多。

祖國的中醫(yī)藥在治療骨病有悠久歷史和有效地方法，中醫(yī)理論認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥病機為腎虛精虧，髓虛脈痹，腎主骨，腎水既痼，則諸骨枯，導(dǎo)致腎虛腰脊疼痛、下肢痿弱、耳鳴耳聾等癥。骨質(zhì)疏松癥病位在骨，其本在腎，從腎著手治療是根本大法之一。腎與骨的生理、病理有密切關(guān)系，即“腎主骨”的理論。骨碎補味苦、性溫，入肝、腎經(jīng)。功用補腎活血、止血，始載于《雷公炮炙論》，主治腎虛腰痛，跌打閃挫，骨傷，風(fēng)濕痹痛，臨床多用于各種骨病。按照中醫(yī)理論骨碎補可以治療各種原因?qū)е碌挠捎谀I虛引起的骨質(zhì)疏松。

正品骨碎補：為水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kunze）JSmith的干燥根莖，性溫，味苦，入肝、腎二經(jīng)，具有補腎、活血、止血的功能?，F(xiàn)代研究表明：骨碎補根莖主要含柚皮苷物質(zhì)和總黃酮，總黃酮對骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨密度下降有明顯抑制作用[2]。骨碎補總黃酮可以在抑制破骨細(xì)胞活性的同時，促進成骨細(xì)胞增殖。在近幾年的臨床應(yīng)用中也證明骨碎補總黃酮對骨質(zhì)疏松的治療作用療效確切。本實驗所用老鷹翅膀為云南民間習(xí)用骨碎補，以下代號：LYCB，觀察LYCB對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型的響，探究其是否具有正品骨碎補防治骨質(zhì)疏松癥的作用，為其臨床有效性提供實驗依據(jù)。

1 材料方法

11 材料 LYCB為石蓮姜槲蕨D propinqua（Wall1）J Smith（四川、廣西）中的老鷹翅膀的提取物，提取率為75%，由云南省藥物研究所天然藥物篩選中心化學(xué)組提供；雌性SD大鼠，體質(zhì)量（300 ±20）g，飼料：SPF大鼠繁殖顆粒飼料，由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（滇）2005-0008，SCXK（滇）2005-0009；動物使用許可證：SYXK（滇）2005-0001；戊巴比妥鈉，sigma公司；雌二醇，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號100801；鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20110714。AG285型電子分析天平，METTLERTOLEDO公司；多功能彩色病理圖像分析管理系統(tǒng)—ZKPALS，北京北海公司；DXC600全自動生化分析儀，貝克曼公司；PV-200足趾容積測量儀，成都泰盟科技有限公司；YLS-16A小動物骨骼強度儀，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

12 方法

121 實驗分組和造模 除12只大鼠留為空白組外，其余大鼠以04%的戊巴比妥鈉麻醉，固定大鼠，在其最末肋骨下與腹正中線交叉處去毛、消毒切開腹部皮膚、肌肉分別摘除雙側(cè)卵巢，縫合切口，抗感染處理；將手術(shù)成功的大鼠隨機分為模型組、雌二醇（陽性藥對照）組和LYCB低、中、高劑量組，每組12只。假手術(shù)組12只，只做手術(shù)切口，不去除卵巢。ig給藥60天，LYCB低、中、高劑量組按01、02、04 g/kg體重劑量給藥，陽性藥組按007 g/kg體重劑量雌二醇給藥，假手術(shù)組和模型組給予陽性組等體積的生理鹽水，每3天稱一次體重。

122 指標(biāo)測定 LYCB治療60 d后，麻醉動物后頸動脈取血，分離血清，用自動生化分析儀測定血清中鈣、磷的含量，堿性磷酸酶（ALP）活性。摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)。

取左側(cè)股骨稱量質(zhì)量，計算骨質(zhì)量系數(shù)；將左側(cè)股骨采用Archimedes原理，用玻璃容器法將骨浸入PV-200足趾容積測量儀中，測得骨標(biāo)本的體積V，然后在室溫下，真空干燥至恒重，稱量干重，計算骨密度。將左側(cè)測定骨密度后的股骨置烘箱中烤至恒定質(zhì)量（90 ℃，24 h），測定其質(zhì)量；在干燥至恒重的馬福爐中灰化（800 ℃，6 h），測定灰質(zhì)量。取右股骨用YLS-16A小動物骨骼強度儀測定各組骨標(biāo)本的抗折力。

取右側(cè)橈骨，常規(guī)固定，脫鈣，切片，HE染色，應(yīng)用多功能真彩色病理圖像分析儀于100倍下，在干骺端生長板下1～4 mm近皮質(zhì)處取視野，為測量范圍，進行骨組織形態(tài)計量學(xué)測定，計算骨小梁個數(shù)、平均骨皮質(zhì)厚度，在高倍鏡視野下觀察多核破骨細(xì)胞數(shù)及成骨細(xì)胞數(shù)。

235 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)采用Excel-2003軟件處理，正態(tài)分布的進行t檢驗和相關(guān)性分析，所有數(shù)值均以（ ±s ）表示。P<005認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。偏態(tài)分布資料采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

21 子宮指數(shù)，Ca、P含量及ALP活性變化：結(jié)果表明與假手術(shù)組比較，模型組子宮指數(shù)明顯降低，P 和ALP濃度明顯升高，說明模型組動物堿性磷酸酶分泌增加；陽性組和LYCB低、中、高劑量組與模型組比較，子宮指數(shù)和Ca升高，p和堿性磷酸酶含量降低，但無顯著差異。結(jié)果見表1

22 骨質(zhì)量、骨密度、抗折力及骨灰分變化：模型組結(jié)果表明與假手術(shù)組比較，骨濕重指數(shù)、骨密度抗折力指數(shù)、骨灰分指數(shù)明顯降低，而陽性組和LYCB各劑量組均有不同程度的增高，有的組與模型組比較升高差異顯著，結(jié)果見表2。

23 大鼠骨組織形態(tài)計量學(xué)和骨細(xì)胞變化：模型組結(jié)果表明與假手術(shù)組比較，骨小梁數(shù)、骨皮質(zhì)厚度成骨細(xì)胞數(shù)明顯降低，破骨細(xì)胞數(shù)明顯增加；而陽性組和LYCB各劑量組，骨小梁數(shù)、骨皮質(zhì)厚度成骨細(xì)胞數(shù)均有不同程度升高，破骨細(xì)胞數(shù)明顯減少。

24 結(jié)論：LYCB各劑量組能不同程度升高子宮指數(shù)、Ca、骨濕重指數(shù)、骨密度抗折力指數(shù)、骨灰分指數(shù)、骨小梁數(shù)、骨皮質(zhì)厚度和成骨細(xì)胞數(shù)，P和堿性磷酸酶含量降低，破骨細(xì)胞數(shù)明顯減少，說明LYCB能明顯降低切除卵巢大鼠的骨丟失，增加骨生成的作用，具有正品骨碎補的抗骨質(zhì)疏松作用。

3 討論

31 摘除卵巢致大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立 骨質(zhì)疏松癥是以骨量降低和骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病[3]。其機制是骨吸收與骨形成作用的失衡，導(dǎo)致骨骼的生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，骨的質(zhì)量降低而容易發(fā)生骨折[4]。骨質(zhì)疏松癥在絕經(jīng)后婦女發(fā)病率最高，雌激素缺乏是PMOP的首要病因。雌性大鼠的卵巢被切除以后，松質(zhì)骨的骨量減少，骨代謝活躍，骨強度下降，伴隨骨轉(zhuǎn)換增強出現(xiàn)松質(zhì)骨明顯骨丟失，然后部分部位骨丟失速度減慢。這些松質(zhì)骨骨丟失是伴隨骨轉(zhuǎn)換增強而進行的，這種特性較好地模仿了人正常絕經(jīng)時高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松發(fā)生時的骨丟失狀態(tài)。同時，手術(shù)后雌性大鼠在骨質(zhì)疏松性骨折和骨量減少部位上，也表現(xiàn)出與人類很大的相似性。切除卵巢的大鼠經(jīng)給予合適的雌激素進行替代試驗時并不增加骨轉(zhuǎn)換和骨喪失。這與絕經(jīng)后婦女對雌激素替代法的反應(yīng)相一致[5]。手術(shù)摘除大鼠的雙側(cè)卵巢（OVX）形成骨質(zhì)疏松模型，已被公認(rèn)和采納，經(jīng)7～12周就可造成模型。本實驗采用摘除卵巢大鼠為模型，能較好的模擬絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥狀。

本實驗采用6月齡雌性大鼠切除卵巢法建立骨質(zhì)疏松模型[6～7]，從60 d后模型組與假手術(shù)組的子宮指數(shù)降低，骨密度與骨礦物質(zhì)含量有顯著性差異，抗折力指數(shù)降低，骨灰分指數(shù)降低，同時血清中Ca濃度明顯降低，ALP顯著升高，股骨骨小梁數(shù)量減少，皮質(zhì)變薄，成骨細(xì)胞數(shù)減少，破骨細(xì)胞數(shù)增多證明骨質(zhì)疏松造模成功。

32 LYCB對模型大鼠血清ALP、Ca、P含量的影響 血清ALP是常用的評價骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)。血清中ALP有50%來自于破骨細(xì)胞分泌，而另一半絕大部分來源于肝臟。血清ALP活性可反映破骨細(xì)胞活躍情況。本實驗結(jié)果顯示：LYCB組與模型組比較，血清中ALP有降低趨勢，表明LYCB具有抑制骨吸收，降低骨吸收，提高骨質(zhì)量的作用。

鈣和磷是人體不可缺少的物質(zhì)，他們以無機鹽的形式存在于骨組織中。鈣攝入不足是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的一個重要因素，特別是女性對鈣的攝入量一般要低于男性，而隨年齡增長腸道的鈣吸收能力又明顯減低[8]。本實驗結(jié)果顯示：與模型組比較，LYCB高劑量組血清Ca含量顯著升高，而P含量有升高趨勢，表明LYCB能抑制血漿中Ca、P含量的丟失。

33 LYCB對模型大鼠骨密度和骨組織形態(tài)學(xué)的影響 骨組織強度與骨量有關(guān)，還與骨組織結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[9]。骨量減少是骨質(zhì)疏松癥的主要病理變化之一，亦是引起骨質(zhì)疏松骨折的一個主要原因，在臨床及研究中常用骨密度（BMD）表示骨量。本實驗結(jié)果顯示：LYCB組與模型組比較，大鼠骨密度有顯著提高，骨灰分指數(shù)增高。大鼠骨小梁數(shù)目增多，骨皮質(zhì)厚度增加，表明LYCB能有效抑制摘除卵巢導(dǎo)致的骨礦物質(zhì)丟失和骨組織顯微結(jié)構(gòu)的改變，抑制骨密度和骨質(zhì)量的降低，增加機體骨的機械強度。

34 LYCB對模型大鼠骨力學(xué)的影響 骨質(zhì)疏松后，骨的結(jié)構(gòu)和材料力學(xué)性能參數(shù)均有不同程度的下降，骨抵抗外力的能力降低[10]。而一種藥物對骨質(zhì)疏松的治療效果也可通過用藥前后骨的力學(xué)性能變化情況，最直觀的表現(xiàn)出來，即力學(xué)性能參數(shù)是反映和評價骨質(zhì)量的最直接的指標(biāo)。本實驗結(jié)果顯示：空白組與模型組比較，模型組骨生物力學(xué)參數(shù)顯著降低，這與臨床骨質(zhì)疏松容易導(dǎo)致骨折的情況吻合，而LYCB組骨生物力學(xué)參數(shù)顯著提高，表明LYCB能防止骨韌性、降低骨脆性增加，從而減少大鼠骨折的發(fā)生率，增強抵抗外力沖擊能力。

35 LYCB對模型大鼠骨細(xì)胞的影響 成骨細(xì)胞是參與骨代謝的重要細(xì)胞，它與破骨細(xì)胞共同維持著骨代謝重建的平衡。在骨代謝的過程中，破骨細(xì)胞在骨吸收過程中起著主要的作用，舊骨被吸收的速度和持續(xù)時間取決于破骨細(xì)胞的骨吸收活性和破骨細(xì)胞的數(shù)量。如果破骨細(xì)胞的骨吸收活性降低，則骨吸收的范圍減少；反之，則吸收的范圍增大。骨質(zhì)疏松發(fā)生的機理是骨吸收大于骨形成，在骨的重建過程中無法完全修復(fù)被吸收的骨質(zhì)，使其骨量不斷減少，骨質(zhì)下降。因此，治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵是促進成骨細(xì)胞的成骨過程，緩解破骨細(xì)胞的破骨過程[11]。本實驗結(jié)果顯示：LYCB組與模型組比較，模型組成骨細(xì)胞數(shù)顯著減少，破骨細(xì)胞數(shù)顯著增多，而LYCB組成骨細(xì)胞數(shù)顯著增多，破骨細(xì)胞數(shù)顯著減少，表明LYCB能促進成骨細(xì)胞的增多，抑制破骨細(xì)胞的增加，從而促進骨形成，抑制骨吸收。

綜上所述，LYCB能有效抑制摘除卵巢所致骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨質(zhì)丟失，抑制骨吸收，促進骨形成，改善骨代謝的負(fù)平衡狀態(tài)，與正品骨碎補一樣對摘除卵巢導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥具有良好的防治作用，但對于減少骨質(zhì)丟失的作用機理還不明確，有待進一步研究。

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