何為，張?jiān)莉?，李永紅

摘要：采集江安河及府河淤泥樣本，采用BTB培養(yǎng)基與N-（1-萘基）-乙二胺光度法篩選出20株具有反硝化能力的好氧菌株。選取其中5株反硝化能力較強(qiáng)的DM1、DM2、DM3、DM4和DM5菌株，進(jìn)行NO3--N去除率測(cè)定，其48 h NO3--N去除率均達(dá)到了30%以上。其中DM1、DM2、DM3和DM5菌株氮去除率依次為43.9%、47.6%、47.9%和51.3%。對(duì)DM5菌株進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定，進(jìn)行pH值和溫度對(duì)反硝化速率影響測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明在pH 7.0～7.4，溫度20～30 ℃時(shí)，DM5菌株反硝化效果較好。

關(guān)鍵詞： 好氧；反硝化細(xì)菌；分離；反硝化效率

中圖分類(lèi)號(hào)：Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）05-1053-04

Screening of Aerobic Denitrifying Bacteria

HE Wei，ZHANG Yue-xiao，LI Yong-hong

（College of Chemical Engineering， Sichuan University， Chengdu 610225， China）

Abstract： By using BTB medium and N-（1-naphthyl）-ethylenediamine photometry， twenty aerobic strains that were capable of denitrification were isolated from the silt samples of JIANG AN river and FU river. Being more capable， five individuals numbered as DM1， DM2， DM3， DM4 and DM5 of the above strains were selected to determine the nitrate removal rate. The results of determination of aerobic denitrifying activity showed that the nitrate removal rate of all the five strains was more than 30%. And the nitrate removal rate of DM1，DM2，DM3 and DM5 was 43.9%，47.6%，47.9% and 51.3% respectively. The determination of the DM5 growth curve as well as the influence of the pH value and temperature on denitrification rates showed that when the pH value range for DM5 was 7.0～7.4 and the temperature was between 20 ℃ and 30 ℃， the efficience of nitrogen removal was better.

Key words： aerobic； denitrifying bacteria； screening； nitrate removal rate

工業(yè)生產(chǎn)中未經(jīng)處理的含氮廢水的排放造成了我國(guó)河流、湖泊及海洋氮含量普遍增高，進(jìn)一步導(dǎo)致湖泊富營(yíng)養(yǎng)化、海洋赤潮等現(xiàn)象，極大地危害到水生物的生存繁衍以及人類(lèi)自身的健康。此外，農(nóng)用氮肥的使用加大了地下水硝酸鹽污染程度，硝酸鹽可在一定條件下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽極易致癌，危害人們生命。我國(guó)地下水合格率僅為30%[1]，因此，探究高效經(jīng)濟(jì)的脫氮工藝迫在眉睫。

傳統(tǒng)的物化脫氮法包括吹脫法[2]、MAP沉淀法、膜法、折點(diǎn)加氯法和離子交換法，主要用于高濃度含氮廢水處理，而對(duì)于低濃度含氮廢水而言其成本相對(duì)過(guò)高，而運(yùn)用新型生物脫氮法進(jìn)行低濃度廢水處理則優(yōu)勢(shì)明顯?，F(xiàn)階段生物脫氮法主要包括活性污泥法[3]、固定化生物脫氮[4]以及微生物制劑[5]等，其理論技術(shù)都趨于成熟，然而其前提條件是找到一種反硝化效率較強(qiáng)的菌株。

本研究以江安河和府河淤泥為基礎(chǔ)，以硝酸鉀為惟一氮源，以梯度劃線(xiàn)法和BTB平板篩選等方法相結(jié)合進(jìn)行好氧反硝化細(xì)菌的篩選，得到反硝化效率較高的菌株，并對(duì)所得菌株反硝化能力進(jìn)行pH值以及溫度影響的評(píng)估，以得到菌株最適的反硝化條件，為生物脫氮提供新的菌種選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 從江安河和府河采取污泥樣本進(jìn)行菌株篩選以及反硝化性能的研究。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 LB液體培養(yǎng)基（1 L）：KNO3 1.00 g、KH2PO4 1.00 g、FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 1.20 g、琥珀酸鈉8.60 g，1×105 Pa滅菌20 min；BTB初篩培養(yǎng)基[6] （1L）：瓊脂20.00 g、KNO3 1.00 g、KH2PO4 1.00 g、FeCl2·6H2O 0.50 g、CaCl2·7H2O 0.20 g、MgSO4·7H2O 1.20 g、琥珀酸鈉8.50 g、溴百里酚藍(lán)（BTB）（1%乙醇溶液）1 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0～7.3，1×105 Pa滅菌20 min；DM反硝化培養(yǎng)基（1 L）：KNO3 0.72 g、KH2PO4 1.00 g、MgSO4·7H2O 1.00 g、琥珀酸鈉4.30 g，1×105 Pa滅菌20 min；鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺光度法[7]所用試劑：鹽酸溶液和對(duì)氨基苯磺酸溶液；紫外分光光度法[8]所用試劑：鹽酸溶液和氨基磺酸銨溶液。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌富集 取適量江安河和府河淤泥分別加入盛有50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.2 細(xì)菌初篩 吸取適量富集后的培養(yǎng)液，分別進(jìn)行104、105、106及107倍稀釋。用移液器分別吸取稀釋后的培養(yǎng)液0.1 mL均勻涂布于BTB固體培養(yǎng)基上，在溫度為30 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。由于反硝化過(guò)程中NO3-還原會(huì)使培養(yǎng)基的pH值升高，試驗(yàn)中所用的選擇性培養(yǎng)基（BTB初篩培養(yǎng)基）所含的產(chǎn)堿指示劑溴百里酚藍(lán)能夠準(zhǔn)確地指示這一變化，而顯現(xiàn)出藍(lán)色，因此選取使周?chē)囵B(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的單菌落作為初篩菌株。

1.2.3 細(xì)菌復(fù)篩 將上述初篩得到的菌株，用接種環(huán)在無(wú)菌條件下接種到盛有50 mL DM反硝化液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，在溫度為30 ℃、搖床速率為180 r/min的條件下培養(yǎng)48 h。再將培養(yǎng)后的菌株接種到新鮮的DM反硝化液體培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)48 h。重復(fù)上述步驟4次，可基本得到純化菌株。利用鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺光度法檢測(cè)培養(yǎng)液中是否有NO2-產(chǎn)生。選取變紅的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行NO3-含量測(cè)定，得到能使NO3-明顯降低的菌株作為復(fù)篩菌株。將復(fù)篩后得到的菌株接種于DM反硝化斜面，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.4 好氧反硝化細(xì)菌反硝化速率測(cè)定 菌懸液的制備：從斜面中，用接種環(huán)接一環(huán)細(xì)菌于裝有20 mL DM反硝化培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，在溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)16 h后，保存于4 ℃冰箱。在盛有20 mL新鮮DM培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中接入0.5 mL上述菌懸液，在溫度為25 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下培養(yǎng)。以未接種菌株的DM液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每隔24 h測(cè)定NO3-濃度，連續(xù)檢測(cè)48 h。檢測(cè)方法為紫外分光光度法，所用儀器為北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TU-1810紫外分光光度計(jì)。以上試驗(yàn)均設(shè)置2個(gè)平行樣，最終數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.5 好氧反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定 移取1 mL細(xì)菌菌懸液于盛有100 mL新鮮DM培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在溫度為25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下培養(yǎng)。以未接種菌株的DM培養(yǎng)基作為對(duì)照，培養(yǎng)6 h后，每隔4 h取一次樣。用TU-1810紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其光密度值。利用細(xì)菌濃度與光密度值成正比的關(guān)系，繪制光密度值和時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)，即為細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.6 pH對(duì)好氧反硝化細(xì)菌反硝化效率的影響測(cè)定 分別移取0.5 mL細(xì)菌菌懸液接種于pH為3.0、5.0、7.0、8.0、9.0及11.0盛有50 mL新鮮DM培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在溫度為25 ℃、搖床速率為160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，用紫外分光光度法檢測(cè)培養(yǎng)液中NO3--N濃度。

1.2.7 溫度對(duì)好氧反硝化細(xì)菌反硝化效率的影響測(cè)定 將細(xì)菌菌懸液以0.5 mL的含量接種于盛有50 mL新鮮DM反硝化培養(yǎng)基的的250 mL三角瓶中，分別在溫度為15、20、25、30及45 ℃條件下培養(yǎng)。48 h后，用紫外分光光度法檢測(cè)培養(yǎng)液中NO3--N濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 好氧反硝化細(xì)菌篩選結(jié)果

從江安河和府河淤泥中初篩得到能使BTB培養(yǎng)基變藍(lán)的菌株30株，且均是從稀釋106倍的涂布平板得到，其中江安河淤泥中篩選得到菌株18株，府河淤泥中篩選得到菌株12株。為保證菌株的單一性，之后對(duì)上述試驗(yàn)得到的菌株進(jìn)行了5次DM液體培養(yǎng)基純化。復(fù)篩時(shí)，培養(yǎng)液中分別滴加對(duì)氨基苯磺酸溶液和鹽酸N-（1-萘基）-乙二胺溶液，培養(yǎng)液能變紅的細(xì)菌菌株共20株。其原理在于反硝化過(guò)程中會(huì)生成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸生成重氮鹽，再與N-（1-萘基）-乙二胺偶聯(lián)生成紅色染料。因此這也證明了這20株菌在好氧情況下能夠進(jìn)行反硝化過(guò)程的第一步，確實(shí)是我們需要篩選得到的細(xì)菌。為了進(jìn)一步明確菌株的反硝化作用效果，試驗(yàn)利用紫外分光光度法測(cè)量NO3--N濃度，得到能使其明顯降低的細(xì)菌菌株16株，篩選得到降解硝酸鹽能力較強(qiáng)的細(xì)菌菌株5株，編號(hào)分別為DM1、DM2、DM3、DM4及DM5。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反硝化能力較強(qiáng)的5株好氧反硝化細(xì)菌均篩選自江安河的淤泥中，并且在DM反硝化液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液均會(huì)變?yōu)榫G色粘稠狀，但顏色程度有所不同（圖1），上述結(jié)果與李永勇等[9]的研究結(jié)果相似。

2.2 好氧反硝化細(xì)菌DM5的形態(tài)特征

將篩選得到的DM5菌株在平板上劃線(xiàn)，于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，其結(jié)果如圖2所示，菌株呈乳黃色，光滑濕潤(rùn)，易挑取。對(duì)DM5菌株進(jìn)行電鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)DM5菌株大小約為0.3～0.5 μm×0.8～0.9 μm（圖3）。進(jìn)一步對(duì)DM5菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，初步鑒定其為銅綠假單胞菌屬（P. Aeruginosa）。

2.3 好氧反硝化細(xì)菌的反硝化效率

利用紫外分光光度法，首先繪制NO3-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖4），試驗(yàn)以最終篩選的5株細(xì)菌為研究對(duì)象，進(jìn)行NO3-去除效率的測(cè)定，得到其48 h后的反硝化結(jié)果（圖5）。由圖5可知，其中DM5菌株反硝化效率最高，其N(xiāo)O3-的去除率為51.3%，DM1、DM2及DM3的NO3-去除率均在40%以上。

在試驗(yàn)具體操作過(guò)程中，由于紫外分光光度法只適合于低濃度的NO3-含量的檢測(cè)，因此在進(jìn)行好氧反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液的NO3-檢測(cè)時(shí)，本試驗(yàn)將培養(yǎng)液上清液進(jìn)行了50倍稀釋。此外由于試驗(yàn)過(guò)程中細(xì)菌培養(yǎng)液均有不同程度的綠色，會(huì)極大地影響硝酸鹽氮含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，因此本試驗(yàn)進(jìn)行了脫色，并且由于傳統(tǒng)的氫氧化鋁懸浮液脫色法試劑難以配制，試驗(yàn)改用氫氧化鋅法脫色，取得了較好效果。由于是好氧反硝化細(xì)菌，為了增加溶解氧，試驗(yàn)過(guò)程中采用4層紗布封口，并以速率為160 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)，提高了氧傳遞效率，充分滿(mǎn)足了好氧條件。試驗(yàn)證明所篩選菌株在48 h內(nèi)即可去除大部分NO3-，從而具有較高脫氮效率。將此類(lèi)菌株應(yīng)用于廢水處理過(guò)程中，在通過(guò)縮短工作周期提高脫氮效率方面有很大的優(yōu)勢(shì)和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4 好氧反硝化細(xì)菌DM5的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由于細(xì)菌濃度與細(xì)菌培養(yǎng)液的OD值成正比，試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液在540 nm處的OD值繪制DM5菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖6）。細(xì)菌生長(zhǎng)周期分為延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期以及衰亡期，由圖6可知，DM5接種后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期從16 h開(kāi)始，從25 h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，從40 h開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。由黃運(yùn)紅等[10]對(duì)反硝化作用主要發(fā)生時(shí)間的分析知，反硝化作用時(shí)間主要集中在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，DM5在16～25 h期間即可從很大程度上發(fā)揮反硝化作用。

2.5 pH對(duì)好氧反硝化細(xì)菌DM5反硝化效率的影響

細(xì)菌生長(zhǎng)代謝均有最適的pH，低于或者高于此值，其代謝活動(dòng)便會(huì)受到抑制。試驗(yàn)以DM5菌株為研究對(duì)象，在不同pH值、相同溫度以及相同搖床速率的條件下探究pH對(duì)其反硝化效率的影響。由結(jié)果（圖7）可知，當(dāng)pH在7.0時(shí)，NO3--N濃度降低最多，當(dāng)pH為弱堿性時(shí)反硝化效率較pH呈酸性時(shí)要高，其結(jié)果與黃廷林等[11]的研究結(jié)果相似。因此在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)避免在酸性及強(qiáng)堿性條件下處理含氮廢水，以免細(xì)菌不能發(fā)揮其應(yīng)有的作用。

2.6 溫度對(duì)好氧反硝化細(xì)菌DM5反硝化效率的影響

溫度的升高會(huì)提高細(xì)菌內(nèi)部酶活性，從而提高細(xì)菌代謝速率，而當(dāng)溫度高于某一值時(shí)，酶活性反而會(huì)受到抑制甚至失活。試驗(yàn)將DM5菌株置于不同溫度下培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)溫度對(duì)DM5菌株反硝化效率的影響。由結(jié)果（圖8）可知，當(dāng)溫度為20～30 ℃時(shí)，DM5菌株反硝化效率較高，NO3--N的去除率均在40%以上，表明所篩選的菌株具有較寬的適宜溫度范圍；而當(dāng)溫度不在此范圍內(nèi)時(shí)，NO3--N去除率明顯降低。由于是在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，DM5菌株的反硝化效率與在相同溫度下的搖床中培養(yǎng)相同時(shí)間的反硝化效率相比稍有降低，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了該細(xì)菌的好氧性。

3 結(jié)論

本研究以硝酸鉀為惟一氮源，琥珀酸鈉為惟一碳源，利用稀釋法以及BTB篩選培養(yǎng)基，從江安河中篩選得到去氮能力較強(qiáng)的5株菌株，編號(hào)為DM1、DM2、DM3、DM4及DM5。其中DM4菌株脫氮效率為30%，DM1、DM2以及DM3菌株脫氮效率均達(dá)到40%以上，DM5菌株達(dá)到50%以上。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程均在好氧情況下進(jìn)行，篩選得到的細(xì)菌均是好氧菌株，與傳統(tǒng)的厭氧或微氧脫氮相比，好氧脫氮時(shí)間更短，效率更高，更易進(jìn)行工業(yè)化。

通過(guò)對(duì)DM5菌株的形態(tài)以及生理生化試驗(yàn)，初步判定其為銅綠假單胞菌屬。對(duì)DM5菌株脫氮效率進(jìn)行pH及溫度影響研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為20～30 ℃、pH 7.0時(shí)，其脫氮效率較高。此外，DM5菌株在微堿性環(huán)境下比在酸性條件下脫氮效率要高。

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