羅喜榮等

摘要：探討超臨界CO2萃取瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）中總黃酮的優(yōu)化工藝條件，采用響應(yīng)曲面法考察萃取壓力、萃取溫度、乙醇用量對(duì)總黃酮收率的影響。結(jié)果表明，優(yōu)化的萃取條件為萃取壓力27 MPa、萃取溫度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此條件下總黃酮收率為1.412%。

關(guān)鍵詞：瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）；總黃酮；超臨界CO2萃?。豁憫?yīng)曲面法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1404-02

瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）是瑞香科狼毒屬植物，其藥用部位為根，在中國(guó)西北、西南、東北等地區(qū)廣為分布，資源極其豐富?，F(xiàn)代藥理研究及臨床應(yīng)用表明，瑞香狼毒具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻止細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，其抗腫瘤作用效果顯著[1]。瑞香狼毒具有結(jié)構(gòu)較特殊的雙二氫黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、木脂素類(lèi)等化合物，有利于抗腫瘤活性物質(zhì)的篩選，是理想的天然藥物開(kāi)發(fā)品種。有研究表明瑞香狼毒的總黃酮提取物急性毒性較小，對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，其作用強(qiáng)于長(zhǎng)春新堿，對(duì)小鼠移植性腫瘤抑制率與環(huán)磷酰胺接近，能明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其作用呈現(xiàn)明顯的劑量-時(shí)間依賴(lài)性，具有很大的潛在藥用價(jià)值[2，3]。

目前瑞香狼毒總黃酮的提取方法主要有回流提取法、索氏提取法、超聲波輔助提取法等[4，5]，這些方法耗時(shí)較長(zhǎng)、溶劑用量大。超臨界CO2萃取技術(shù)具有步驟簡(jiǎn)單、選擇分離效果好、提取率高、不破壞活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，本研究采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法對(duì)超臨界CO2萃取瑞香狼毒中總黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳工藝條件，為瑞香狼毒總黃酮的開(kāi)發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：瑞香狼毒由甘肅省蘭州市生產(chǎn)，將其粉碎成1 mm顆粒備用。試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，所用化學(xué)試劑均為分析純。儀器：4 L超臨界萃取裝置為自行研制，F(xiàn)-2500型熒光分光光度計(jì)購(gòu)自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的提取 采用Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法，以萃取壓力、萃取溫度、乙醇用量為自變量，以總黃酮收率（y）為響應(yīng)指標(biāo)設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)方案，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。取瑞香狼毒粉200 g置于超臨界萃取器，設(shè)定萃取時(shí)間為1 h、CO2流量為20 L/h、解析壓力為5 MPa、解析溫度為60 ℃。當(dāng)達(dá)到預(yù)定溫壓條件，啟動(dòng)夾帶劑泵，定量打入95%乙醇，萃取過(guò)程中從解析器收集萃取液。

1.2.2 總黃酮收率的測(cè)定 精密稱(chēng)取10 mg蘆丁，用甲醇溶解、定容至10 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5、10、15、20、25 μL置于5 mL比色管中，加入0.6 mL 0.1 g/L AlCl3-甲醇溶液，用甲醇定容至刻度，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在激發(fā)及發(fā)射通帶均為10 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為490 nm條件下測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度相對(duì)應(yīng)的濃度繪制工作曲線，得線性回歸方程為■=39.74x+10.41，其中，y為熒光強(qiáng)度，x為蘆丁濃度（μg/mL），相關(guān)系數(shù)r=0.998 4。取一定體積的樣品液揮干用同法測(cè)定，根據(jù)工作曲線計(jì)算總黃酮濃度及收率（y）。y=總黃酮質(zhì)量（g）/原料質(zhì)量（g）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)結(jié)果與模型方程的建立

總黃酮的超臨界CO2提取響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。利用Minitab 16軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得響應(yīng)曲面二次多元回歸模型：■=-3.137 46+0.069 73x1+0.105 27x2+0.393 60x3-0.001 40x12-0.001 06x22-0.047 29x32+0.000 13x1x2+0.000 09x1x3+0.001 02x2x3，對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表3可知，模型P=0.001<0.01，表明該模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.062>0.05不顯著，R2=0.983 2說(shuō)明該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，可以用此模型對(duì)總黃酮的超臨界CO2提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由表4可知模型中一次項(xiàng)x1、x2及二次項(xiàng)x12顯著，二次項(xiàng)x22極顯著，其他項(xiàng)均不顯著。

2.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸模型作出響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖1至圖3。運(yùn)用軟件響應(yīng)優(yōu)化器望大尋優(yōu)得到總黃酮最佳提取工藝條件為萃取壓力27.58 MPa、萃取溫度52.73 ℃、乙醇用量3 mL/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行總黃酮的超臨界CO2提取，為方便實(shí)際操作將提取工藝參數(shù)修正為萃取壓力27 MPa、萃取溫度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此條件下總黃酮理論收率為1.437%，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得到總黃酮收率為1.412%，與理論預(yù)測(cè)值非常接近，表明基于響應(yīng)曲面法獲得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)曲面法建立了瑞香狼毒總黃酮收率與萃取壓力、萃取溫度、乙醇用量關(guān)系的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型準(zhǔn)確有效，超臨界CO2萃取瑞香狼毒總黃酮優(yōu)化工藝條件為萃取壓力27 MPa、萃取溫度52 ℃、乙醇用量3 mL/g，此條件下總黃酮收率為1.412%。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒具有抗驚厥、抗癲癇、抗腫瘤、抗菌、抗結(jié)核、抗病毒、抗氧化、改善機(jī)體免疫功能等多種藥理作用，不良反應(yīng)相對(duì)較小、較少，是一種有價(jià)值的宜于深入研究的中藥。

參考文獻(xiàn)：

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[3] 吳曉亮，韓 敏，劉曉松，等. 不同瑞香狼毒提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（9）：5-6.

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