劉占才　許會(huì)才　牛景彥等

摘要：研究了暴露在不同濃度高效氯氰菊酯下草魚（Ctenopharyngodon idellas）血清和脾臟中酸性磷酸酶（ACP）的活性變化。將高效氯氰菊酯濃度設(shè)5組，包括1個(gè)對(duì)照組（0 μg/L）和4個(gè)處理組（0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L），每組分別于暴露1、5、12 d時(shí)取樣，測定血清和脾臟ACP的活性。結(jié)果顯示，暴露1 d時(shí)，血清ACP活性各處理組顯著下降；脾臟ACP活性0.5 μg/L組和1.0 μg/L組顯著升高，3.0 μg/L組和5.0 μg/L組顯著下降。暴露5 d時(shí)，血清ACP活性1.0 μg/L組顯著上升，3.0 μg/L組和5.0 μg/L組顯著下降；脾臟ACP活性1.0、3.0和 5.0 μg/L組顯著下降。暴露12 d時(shí)，血清ACP活性1.0、3.0和5.0 μg/L組顯著下降；脾臟ACP活性各處理組均顯著下降。ACP活性的變化反映了高效氯氰菊酯能夠影響魚體的代謝平衡，對(duì)魚體具有毒害作用；同時(shí)，血清和脾臟的ACP活性對(duì)高效氯氰菊酯早期污染的敏感性可以作為監(jiān)測水體中此類化學(xué)品污染的一個(gè)特異性標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞：高效氯氰菊酯；草魚（Ctenopharyngodon idellas）；酸性磷酸酶；血清；脾臟

中圖分類號(hào)：Q556+.1；S965.112 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）07-1620-03

菊酯類農(nóng)藥因較有機(jī)磷、有機(jī)氯農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類的毒性低，且具有廣譜、高效的優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和家庭病蟲害控制中；在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也被用來殺滅魚體表面的甲殼類寄生蟲和控制有害水生昆蟲的過度繁殖[1]。但是，菊酯類農(nóng)藥的過量使用和隨意排放，可能會(huì)被沖刷到附近的水體中，進(jìn)而對(duì)水環(huán)境造成污染。即使在非常低的濃度下，菊酯類農(nóng)藥也會(huì)對(duì)淡水魚類和其他非靶標(biāo)水生生物產(chǎn)生極大的毒害[2]。因而，評(píng)估菊酯類農(nóng)藥對(duì)非靶標(biāo)水生生物的毒性作用成為研究的熱點(diǎn)[3，4]。酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）（EC 3.1.3.2）是一種對(duì)魚類的生理代謝有著重要影響的酶，通過研究高效氯氰菊酯對(duì)魚類ACP活性的影響，有助于揭示魚體對(duì)菊酯類農(nóng)藥的響應(yīng)機(jī)制。國外在高效氯氰菊酯對(duì)魚類代謝的影響方面開展了大量研究[5，6]，而關(guān)于魚類體內(nèi)ACP的研究則較少，國內(nèi)在這方面更是鮮見報(bào)道。草魚（Ctenopharyngodon idellas）是我國主要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此，探討高效氯氰菊酯對(duì)草魚ACP活性的影響，可以為水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測和漁業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

同批繁殖、同池培育的健康草魚，體重（100±10） g，體長（15±2） cm。高效氯氰菊酯為上海永遠(yuǎn)化工有限公司產(chǎn)品，對(duì)硝基苯磷酸二鈉（pNPP）為BBI公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白（BSA）為AMRESCO公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 草魚適應(yīng)性馴化 將試驗(yàn)用草魚放入容積為200 L（100 cm×50 cm×40 cm）的養(yǎng)殖箱中馴養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖用水為曝氣后的自來水，水溫（25±2） ℃，每3 d換水1次，增氧機(jī)增氧，定時(shí)投喂餌料。

1.2.2 高效氯氰菊酯暴露處理 通過常規(guī)急性毒性試驗(yàn)[7]測出高效氯氰菊酯對(duì)草魚96 h半致死濃度（LC50）為6.1 μg/L。據(jù)此，將試驗(yàn)分為4個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組（CK），每組40尾草魚，每組設(shè)2個(gè)平行。處理組高效氯氰菊酯濃度依次為0.5、1.0、3.0、5.0 μg/L，以4.5%的高效氯氰菊酯乳油和曝氣后的自來水配制；對(duì)照組不加高效氯氰菊酯，用曝氣后的自來水配制。試驗(yàn)水溫23～27 ℃，pH 7.3～7.8，溶氧≥4 mg/L，每天更換1/3試驗(yàn)液，保證各組試驗(yàn)液濃度基本不變。試驗(yàn)開始前1 d停止投餌。試驗(yàn)開始后，于1、5、12 d分別從各組隨機(jī)取10尾魚，用于ACP活性的測定。

1.2.3 血清和酶粗提液制備 從草魚鰓動(dòng)脈采血，每尾取血1 mL置于2.5 mL離心管中，4 ℃下放置24 h分離血清，并于4 ℃下保存待測。采血后迅速解剖魚體，取出脾臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，按1∶19的質(zhì)量體積比加入0.9%的NaCl，冰浴勻漿；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝并儲(chǔ)存于-20 ℃待測。

1.2.4 粗提液蛋白質(zhì)定量測定 蛋白質(zhì)定量測定參照Bradford[8]的方法。

1.2.5 ACP活性測定 ACP活性采用Tenniswood等[9]的方法進(jìn)行測定。酶活性單位定義：28 ℃下反應(yīng)體系中每毫升血清或每克蛋白質(zhì)在15 min內(nèi)催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉生成1 mg對(duì)硝基酚的酶量為1個(gè)酶活單位（U/mL或U/g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2003軟件作圖，并進(jìn)行One-way ANOVA分析和獨(dú)立性t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效氯氰菊酯對(duì)草魚血清ACP活性的影響

不同濃度高效氯氰菊酯暴露下草魚血清ACP活性的變化如圖1所示。由圖1可知，對(duì)照組在1、5、12 d時(shí)血清ACP活性變化不大。暴露1 d時(shí)各處理組ACP活性與對(duì)照組相比，0.5 μg/L組和1.0 μg/L組顯著下降，3.0 μg/L組和5.0 μg/L組極顯著下降；暴露5 d時(shí)各處理組ACP活性與對(duì)照組相比，0.5 μg/L組無顯著變化，1.0 μg/L組極顯著上升，3.0 μg/L組顯著下降，5.0 μg/L組極顯著下降；暴露12 d時(shí)各處理組ACP活性與對(duì)照組相比，0.5 μg/L組無顯著變化，1.0 μg/L組和3.0 μg/L組顯著下降，5.0 μg/L組極顯著下降。

2.2 高效氯氰菊酯對(duì)草魚脾臟ACP活性的影響

不同濃度高效氯氰菊酯暴露下草魚脾臟ACP活性變化如圖2所示。由圖2可知，對(duì)照組在1、5、12 d時(shí)脾臟ACP活性變化不大。暴露1 d時(shí)各處理組ACP活性與對(duì)照組相比，0.5 μg/L組顯著升高，1.0 μg/L組極顯著升高，3.0 μg/L組顯著下降，5.0 μg/L組極顯著下降；暴露5 d時(shí)各處理組ACP活性與對(duì)照組相比，0.5 μg/L組無顯著變化，其他處理組極顯著下降；暴露12 d時(shí)各處理組ACP活性與對(duì)照組相比，0.5 μg/L組顯著下降，其他處理組極顯著下降。

3 討論

ACP是一類在酸性條件下催化磷酸酯水解的酶，在魚類各組織器官中廣泛分布，包括溶酶體性和非溶酶體性兩大類；溶酶體性ACP主要存在于巨噬細(xì)胞，定位于溶酶體內(nèi)[10，11]，是溶酶體的特征性酶，主要參與磷酸酯的代謝，與細(xì)胞的消化、自溶和免疫有關(guān)。非溶酶體性ACP與細(xì)胞增殖、能量轉(zhuǎn)化、質(zhì)膜的吸收與運(yùn)輸功能等一些重要的生物學(xué)功能有關(guān)[12]。由于ACP參與了環(huán)境污染物對(duì)生物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性和遺傳毒性的適應(yīng)性反應(yīng)，可作為檢測環(huán)境污染程度的生物標(biāo)志物[13]。

血液生化參數(shù)是魚體健康狀況的主要指標(biāo)，也是魚類疾病診斷的依據(jù)之一，能夠反映其健康狀況和生理狀態(tài)，血清生化分析可用于監(jiān)測早期氯氰菊酯對(duì)魚類的毒性[14]。本試驗(yàn)中，草魚在低濃度（0.5 μg/L）高效氯氰菊酯下暴露1 d，血清ACP活性顯著下降，表明草魚對(duì)高效氯氰菊酯的敏感性較高，可以作為監(jiān)測養(yǎng)殖水域中高效氯氰菊酯早期污染的一個(gè)生物指標(biāo)。血清中的ACP主要來源于血細(xì)胞[15]，在暴露1 d時(shí)，各處理組血清ACP活性均受到顯著抑制，可能是草魚機(jī)體來不及對(duì)脅迫作出適應(yīng)性反應(yīng)所致；而暴露5 d時(shí)，1.0 μg/L組血清ACP活性極顯著上升，表現(xiàn)出了在毒物的誘導(dǎo)作用下機(jī)體產(chǎn)生的代償性反應(yīng)。Instioris等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，高效氯氰菊酯的脅迫會(huì)導(dǎo)致魚體血細(xì)胞比容下降。因此，隨著脅迫強(qiáng)度的持續(xù)加強(qiáng)，可能會(huì)由于血細(xì)胞比容的下降，引起向血清分泌的ACP量下降，進(jìn)而導(dǎo)致了血清ACP活性的下降。

高效氯氰菊酯對(duì)魚類具有極大的毒性，可以阻礙神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳導(dǎo)，對(duì)魚體生理機(jī)能造成極大影響[17]。脾臟是魚類的主要免疫器官，它的生理狀況可以反映出魚體的健康狀況。在短時(shí)間（1 d）暴露下，草魚脾臟ACP活性表現(xiàn)出較低濃度（0.5 μg/L和1.0 μg/L）下的誘導(dǎo)和較高濃度（3.0 μg/L和5.0 μg/L）下的抑制，這可能與脾臟的功能有關(guān)，作為魚體對(duì)刺激的應(yīng)答反應(yīng)，較低濃度下產(chǎn)生了代謝補(bǔ)償，使機(jī)體具有一定的耐受能力；但較高濃度或長時(shí)間的暴露超出了魚體的調(diào)節(jié)能力，引起機(jī)體功能的失常。

本研究發(fā)現(xiàn)，草魚血清和脾臟的ACP活性對(duì)高效氯氰菊酯具有較高的敏感性，可以作為監(jiān)測水環(huán)境中高效氯氰菊酯早期污染的生物指標(biāo)；高效氯氰菊酯的脅迫對(duì)草魚血清和脾臟ACP活性的顯著影響，表明高效氯氰菊酯能夠?qū)Σ蒴~生理代謝產(chǎn)生明顯影響，對(duì)草魚具有較強(qiáng)的毒性。

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