廖新化

山中伸彌（Shinya Yamanaka）

獲得諾獎已經(jīng)有近一年了，雖然三年前在聽完他的講座后我興致很高地寫了兩篇博客，這些天我卻沒有多少動力再寫一篇完整的文章來介紹他的工作。

我一直對中國現(xiàn)在還盛行的規(guī)劃性科研，應(yīng)用導(dǎo)向型科研耿耿于懷。這些所謂的重大項目在立項的當(dāng)初對目標(biāo)/前景寫得宏大無比，之后卻通常草草收場。如果那些重大項目真的能實現(xiàn)立項當(dāng)初的用意，那諾貝爾獎早就在中國遍地開花了。廣大科研人員都覺得這種運行模式是一個笑話，饒毅、施一公等大牛也重炮轟擊，但是分錢游戲還在進(jìn)行著。而公眾，包括相當(dāng)一部分科研人員也并不了解科研的自身規(guī)律，總是一再地問做基礎(chǔ)研究有什么用。

Shinya Yamanaka的成功是典型的小實驗室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有相當(dāng)多的科學(xué)突破是不可預(yù)測的。如果中國有大批優(yōu)質(zhì)的小實驗室得到穩(wěn)定的資助，那么類似的科學(xué)突破就會隨機但是必然地產(chǎn)生。從這種意義上講，展示Shinya Yamanaka在研究過程中的這種隨機性和必然性，向公眾科普科研活動是如何進(jìn)行的，是值得我花一點時間的。

解析Shinya Yamanaka發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞（iPS）的來龍去脈比較簡單，就是跟蹤他順次研究的基因： ApoBEC1-Nat1-Fbx15，最后發(fā)現(xiàn)iPS。有趣的是他在順次研究這些基因的時候轉(zhuǎn)了兩次方向：ApoB是血脂蛋白，研究它的編輯酶ApoBEC1是為了調(diào)節(jié)血脂，但是卻發(fā)現(xiàn)ApoBEC1過表達(dá)的小鼠得了肝癌；為了研究致癌機理，他找到ApoBEC1的下游蛋白Nat1，Nat1的敲除導(dǎo)致小鼠在胚胎期死亡，以及胚胎干細(xì)胞在體外無法分化；于是他又開始研究起胚胎干細(xì)胞，找到許多胚胎干細(xì)胞特異表達(dá)的基因，其中之一是Fbx15，最后用Fbx15敲除鼠建立assay（篩選方法/系統(tǒng)），幸運地篩選出了iPS。

骨科醫(yī)生到博士階段

Shinya Yamanka念高中時迷上柔道，因為受傷經(jīng)常上醫(yī)院，他在爸爸的建議下隨后考入國立神戶大學(xué)醫(yī)學(xué)部，準(zhǔn)備以后做一名骨科醫(yī)生。大學(xué)畢業(yè)做臨床實習(xí)期間，他發(fā)現(xiàn)自己對手術(shù)其實沒有什么天分，別人做20分鐘的手術(shù)他兩個小時也未必完成；并且他覺得做醫(yī)生再優(yōu)秀也只能幫助少數(shù)的病人，而醫(yī)學(xué)研究有成果的話通?？梢詭椭嗟牟∪?，所以他的興趣轉(zhuǎn)向基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。在大阪市立大學(xué)博士期間，Shinya的主要工作是研究血壓調(diào)節(jié)的分子機理[1， 2]。在研究過程中，Shinya對小鼠基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)感到震驚，于是他在申請博士后位置的時候聯(lián)系的都是利用這些技術(shù)的實驗室。

博士后階段-ApoB-

EC1

這位失敗的骨科醫(yī)生最后被加州Gladstone Institute的Thomas Innerarity納入門下（圖1）。Thomas實驗室研究的是血脂調(diào)節(jié)，跟Shinya博士期間的工作有點關(guān)系。Shinya的新課題是研究ApoB mRNA的編輯蛋白ApoBEC1。

ApoB是低密度脂蛋白的主要構(gòu)成成分。ApoB mRNA可以被編輯酶ApoBEC1脫氨提前終止翻譯，形成兩種不同大小的蛋白：全長的ApoB100和大約一半長的ApoB48。經(jīng)過編輯的ApoB48在血漿中會被迅速清除。Thomas預(yù)測，如果在肝臟中過表達(dá)ApoBEC1，那么血脂就可能降低；如果這個模型可行的話，也許未來通過基因療法可以幫助一些肥胖病人降低血脂。

Shinya一周七天地勤奮工作，花了六個月做成了轉(zhuǎn)基因鼠。有一天早上，幫他維護小鼠的技術(shù)員告訴他：Shinya，你的許多小鼠都懷孕了，可是小鼠是公的。Shinya說你不是跟我開玩笑吧。他到老鼠房一看，果真有很多公鼠看起來懷孕了。他殺了其中幾只，發(fā)現(xiàn)原來是小鼠得了肝癌，肝臟腫大撐大了肚皮。

ApoBEC1過表達(dá)后低密度脂蛋白是降低了，但是高密度脂蛋白卻升高了，同時還得了肝癌，這買賣不合算啊[3]。Shinya在一次講座中總結(jié)了其中的經(jīng)驗教訓(xùn)：其一，科學(xué)是不可預(yù)測的；其二，不要嘗試在病人身上做新基因的治療；其三，也許最重要的是，不要相信導(dǎo)師的假說。

Thomas對結(jié)果不能符合預(yù)期很失望，但是這個預(yù)想之外的結(jié)果卻引起了Shinya的好奇：究竟是什么機理使小鼠得腫瘤的呢？好在Thomas足夠開明，他允許Shinya偏離實驗室的主要方向，繼續(xù)探索ApoBEC1的致癌機理?？梢韵胍?，ApoBEC1過表達(dá)以后也可能會編輯ApoB之外的其他mRNA，找到這些mRNA也許可以解釋ApoBEC1為什么能致癌。

由于已知ApoBEC1需識別底

物mRNA的特異序列才能編輯，Shinya據(jù)此設(shè)計引物擴增，找到了ApoBEC1的一個新底物-抑制蛋白翻譯的基因Nat1。ApoBEC1過表達(dá)后，Nat1蛋白消失[4]。從邏輯上講，如果編輯Nat1是導(dǎo)致ApoBEC1致癌的重要分子，那么Nat1敲除的小鼠也會長癌。

基因敲除比起轉(zhuǎn)基因要更加復(fù)雜，需要把構(gòu)建的質(zhì)粒原位整合到體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞中?；蚯贸夹g(shù)不就是Shinya博士階段做夢都想學(xué)的技術(shù)嗎？于是Shinya找到所里做基因敲除的專家，當(dāng)時還是助理教授的Robert Farese，從他的助手Heather Myers那里學(xué)了這項技術(shù)的每個細(xì)節(jié)，并成功地獲得了Nat1敲除的雜合鼠。Heather Myers是Shinya的終生好友；Shinya發(fā)現(xiàn)iPS以后，也公開表達(dá)了對Heather Myers的感激，因為是她告訴Shinya，胚胎干細(xì)胞不僅僅是做敲除小鼠的手段，其本身也可以是非常有趣的研究對象。

在Shinya興致勃勃地繼續(xù)追問Nat1的功能時，他的妻子帶著女兒離開他回到了日本。半年后他決定中斷研究帶著三只珍貴的Nat1雜合鼠，也跟隨家人回國。

大阪的毛毛蟲階段-Nat1

憑借他在博士后期間發(fā)表的四篇高質(zhì)量的一作論文，1996 年Shinya在母校大阪市立大學(xué)找到了助理教授的職位，繼續(xù)他的Nat1研究。

再一次地與預(yù)測出現(xiàn)偏差：Nat1敲除后，純合子小鼠在胚胎發(fā)育早期就死了，根本無法觀察到成鼠是否得腫瘤。Shinya進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，敲除Nat1的胚胎干細(xì)胞在體外根本不能像正常干細(xì)胞一樣分化[5]。此時他想起了Heather Myers的話：胚胎干細(xì)胞不僅是研究的工具，它本身也可以是非常有趣的研究對象。他的關(guān)注點開始轉(zhuǎn)移到胚胎干細(xì)胞上來。

在剛回大阪的頭幾年，Shinya

由于剛起步，只能得到少量的研究資助，他不得不自己一個人養(yǎng)幾百只小鼠，日子過得非常艱苦。同時大阪市立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的基礎(chǔ)研究很薄弱，周圍的人不理解Shinya研究Nat1在胚胎干細(xì)胞中的功能有什么意義，總是勸說Shinya做一些更靠近醫(yī)藥臨床方面的研究。而Nat1的研究論文提交給雜志后一直被拒稿。種種壓力與不得志，Shinya因之得了一種病叫PAD（Post America Depression，離開美國后的抑郁癥；自創(chuàng)的玩笑話），幾乎要放棄科研回鍋做骨科醫(yī)生。

在他最低谷的時候，有兩件事情把他從PAD中挽救了回來。其一是James Thomson（俞君英的導(dǎo)師，2007年幾乎與Shinya同時宣布做出了人的iPS） 在1998年宣布從人的囊胚中采集并建立了胚胎干細(xì)胞系：這些干細(xì)胞在體外培養(yǎng)幾個月后還可以分化成不同胚層的細(xì)胞，比如腸上皮細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，神經(jīng)上皮細(xì)胞等[6]。這給了Shinya巨大的鼓舞，他開始更加堅信胚胎干細(xì)胞研究是有意義的，將來必然有一天會用于臨床。第二件事是條件更加優(yōu)越的 奈良先端科學(xué)技術(shù)研究生院看上了他的特長，招聘他去建立一個做基因敲除小鼠的facility（中心？設(shè)施？），并給他提供了副教授的職位。

奈良的成蛹階段-Fbx15

千辛萬苦脫了幾層皮后，Shinya終于擁有了自己獨立的實驗室。第一次可以招幫手，好爽啊。但是問題又來了：研究生的生源是有限的，學(xué)生會傾向于選擇資歷更老條件更好的實驗室，而不一定會選擇剛起步的實驗室；你想招但人家不來啊。為了吸引學(xué)生到他實驗室，Shinya冥思苦想了好一陣，提出了一個雄心勃勃的計劃，聲稱實驗室的遠(yuǎn)景目標(biāo)是研究怎么從終末分化的成體細(xì)胞變回多能的干細(xì)胞。

當(dāng)時科學(xué)界的主流是研究怎么把胚胎多能干細(xì)胞分化成各種不同組織的細(xì)胞，以期用這些分化的功能細(xì)胞取代受損的或者有疾病的組織細(xì)胞。Shinya認(rèn)為自己的實驗室沒有實力跟這些大牛競爭，那不如反其道而行之，研究怎么從分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞。

當(dāng)時科學(xué)界的主流觀點認(rèn)為，哺乳動物胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞分化是單向的，就像是時間不可逆轉(zhuǎn)。這個觀點也并非沒有破綻，比如植物組織就具有多能性，一些植物的莖插入土壤會重新長出一棵植株，也即已經(jīng)分化的莖細(xì)胞可以改變命運分化出新的根莖葉細(xì)胞。而早在1962年，也即Shinya出生的那一年，英國的John Gurdon爵士（與Shinya共享諾貝爾獎）報道了他的驚人發(fā)現(xiàn)：把蝌蚪的腸細(xì)胞核移植到去核的蛙卵中，新細(xì)胞可以發(fā)育成蝌蚪[7]。如果把雜合細(xì)胞發(fā)育到囊胚期，用囊胚期的細(xì)胞核再做一次核移植，那么就可以發(fā)育出可生育傳代的成蛙[8]。進(jìn)一步地，為了說服人們接受終末分化的細(xì)胞核也具有多能性，他把成蛙不同組織的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)核移植后來源不同的雜合細(xì)胞都可以發(fā)育到蝌蚪階段[9]。1997年，Ian Wilmut和Keith Campbell基于同樣的原理，把羊的乳腺細(xì)胞核移植到去核的羊卵中，成功地培育出了克隆羊多莉[10]。2001年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，通過與 干細(xì)胞融合，胸腺細(xì)胞核獲得了很大程度的重編程[11]。

Shinya計劃的第一步是找到盡可能多的，類似于Nat1參與維持干細(xì)胞功能的因子（維持因子的意思是這些因子是胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)維持多能性所必需的）。他大膽推測，如果過表達(dá)這些維持因子也許可以讓終末分化的細(xì)胞變回多能干細(xì)胞。一旦成功，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞會有著胚胎干細(xì)胞所不具備的優(yōu)勢：它不僅可以繞開胚胎干細(xì)胞引起的倫理問題，病人本身的誘導(dǎo)干細(xì)胞改造后重新植入病人時，由于是自身的細(xì)胞，將不會有免疫排斥的難題。

在這個遠(yuǎn)大前景的感召下，Shinya果然“忽悠”了三個學(xué)生加入他實驗室。很快地，他們鑒定出一系列的在胚胎干細(xì)胞特異表達(dá)的基因。其中一個基因就是Fbx15。Shinya的學(xué)生Yoshimi Tokuzawa發(fā)現(xiàn)Fbx15除了特異表達(dá)于胚胎干細(xì)胞外，它還能被另外兩個胚胎干細(xì)胞維持因子Oct3/4和Sox2直接調(diào)控。Shinya跟Yoshimi說：Fbx15應(yīng)該參與維持干細(xì)胞多能性和胚胎的發(fā)育，我猜你沒有辦法得到Fbx15敲除的純合鼠。Yoshimi構(gòu)建質(zhì)粒做了基因敲除小鼠，把染色體上的Fbx15基因通過同源重組替換成抗G418藥物的基因neo。

復(fù)雜的生命又一次愚弄了Shinya：Fbx15敲除的純合鼠活得很健康，沒有顯見的表型。Shinya又挑戰(zhàn)他的學(xué)生說：好吧，F(xiàn)bx15也許不是小鼠胚胎發(fā)育所必需的，但是它應(yīng)該是維持體外胚胎干細(xì)胞所必需的，我打賭你沒有辦法在胚胎干細(xì)胞中徹底敲除這個基因。勤快的Yoshimi于是用較高濃度的G418從干細(xì)胞中篩到了純合的敲除株，還是活得好好的，沒有表型[12]。Shinya后來在回憶的時候打趣道：小鼠很happy，細(xì)胞也很happy，唯一不happy的就是可憐的學(xué)生Yoshimi了。

但是花這么多精力做的敲除小鼠不能就這么算了吧。Shinya又一次開動腦筋，想要廢物利用。他發(fā)現(xiàn)由于Fbx15只在胚胎干細(xì)胞表達(dá)，F(xiàn)bx15 promoter操控的抗藥基因neo在成體的成纖維細(xì)胞里不表達(dá)，所以細(xì)胞對藥物 G418敏感；而敲除鼠里得到的胚胎干細(xì)胞卻可以在很高濃度的 G418中生長。如果終末分化的成纖維細(xì)胞能誘導(dǎo)成胚胎干細(xì)胞，那么它就會產(chǎn)生對 G418的 抗藥性。即便成纖維細(xì)胞只是獲得了部分胚胎干細(xì)胞的特性，那么它也應(yīng)該能抗低濃度的 G418 （圖2）。Fbx15敲除鼠實際上提供了很好的篩選誘導(dǎo)干細(xì)胞的系統(tǒng)！

京都大學(xué)的化蛹成蝶階段-iPS

憑借他鑒定胚胎干細(xì)胞維持因子的出色工作，2004年Shinya在名氣更大的京都大學(xué)找到新的職位。除了Fbx15敲除鼠的篩選系統(tǒng)，Shinya還積累了他鑒定的加上文獻(xiàn)報道的24個維持因子。Shinya躍躍欲試，他準(zhǔn)備破殼而出，拍翅成蝶了！

Shinya的另一位學(xué)生Kazutoshi Takahashi此前已經(jīng)發(fā)表了一篇關(guān)于干細(xì)胞致癌性的Nature文章。Shinya決意讓他來承擔(dān)最大膽的課題-逆分化成體細(xì)胞，因為他知道，有一篇Nature文章保底，即便接下來的幾年一無所獲，他的學(xué)生也能承受得了。

在Fbx15敲除鼠基因組，F(xiàn)bx15 基因被βgeo基因（β-galactosidase 和 neo的融合基因）取代。成鼠角形的成纖維細(xì)胞中，內(nèi)源的Fbx15 promoter關(guān)閉，βgeo不能表達(dá)，細(xì)胞在G418藥物處理下會死亡；在圓形的多能干細(xì)胞中，F(xiàn)bx15 promoter會啟動βgeo，細(xì)胞能在G418中生長。如果成纖維細(xì)胞感染攜帶干細(xì)胞維持因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒，并能夠被逆分化成干細(xì)胞，那么它就能逃過G418的選擇壓力，增殖形成細(xì)胞克隆[13]。

即便有很好的篩選系統(tǒng)，這個課題在當(dāng)初看來也是非常冒險甚至是不可行的。當(dāng)時的人們普遍認(rèn)為成體細(xì)胞失去了多能性，也許成體細(xì)胞本身就是不可逆轉(zhuǎn)的，你做什么也沒有用。即便通過轉(zhuǎn)核技術(shù)實現(xiàn)了成體細(xì)胞核命運的逆轉(zhuǎn)，那也只是細(xì)胞核，不是整個細(xì)胞。胚胎細(xì)胞和成體細(xì)胞的染色體是一樣的，細(xì)胞核具有全能性，尚可理解。而且要實現(xiàn)細(xì)胞核的逆轉(zhuǎn)還需要轉(zhuǎn)到卵細(xì)胞，讓卵細(xì)胞質(zhì)幫助它重編程，而卵細(xì)胞質(zhì)中的蛋白不計其數(shù)。如果要實現(xiàn)整個細(xì)胞命運的逆轉(zhuǎn)需要讓細(xì)胞質(zhì)中所有的蛋白重新洗牌。即便細(xì)胞可以重新編程，那也應(yīng)該是很多蛋白共同參與的。Shinya當(dāng)年在手上的僅僅是24個因子。也許有另外幾百幾千種因子被遺漏，缺少其中一種都無法實現(xiàn)重編程。用這24個因子異想天開要實現(xiàn)細(xì)胞重編程，根據(jù)已有的知識從邏輯上講可能性幾乎為零。

Kazutoshi這個愣頭青不管這些，他給成纖維細(xì)胞一一感染過表達(dá)這些因子的病毒，結(jié)果當(dāng)然沒有篩選到任何抗 G418的細(xì)胞。Shinya知道如何保持學(xué)生的斗志，他故作鎮(zhèn)定地說：你看，這說明我們的篩選系統(tǒng)很好啊，沒有出現(xiàn)任何假陽性。

在試了一遍無果后，Kazuto-

shi大膽提出想把24個病毒混合起來同時感染細(xì)胞。Shinya覺得這是很愚蠢的想法：沒人這么干過啊同學(xué)，不過死馬當(dāng)作活馬醫(yī)，你不嫌累的話就去試吧。

等了幾天，奇跡竟然發(fā)生了。培養(yǎng)板上稀稀疏疏地竟然出現(xiàn)了十幾個抗 G418的細(xì)胞克??！一個劃時代的發(fā)現(xiàn)誕生了。

關(guān)鍵實驗取得突破以后，其后的事情就按部就班了。Kazutoshi每次去掉一個病毒，把剩下的23個病毒混合感染成體細(xì)胞，看能長多少克隆，以此來鑒別出哪一些因子是誘導(dǎo)干細(xì)胞所必需的。最后他鑒定出了四個明星因子：Oct3/4， Sox2， c-Myc，和 Klf4。這四個因子在成纖維細(xì)胞中過表達(dá)，就足以把它逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞！

那抗 G418的細(xì)胞克隆就一定是多能干細(xì)胞嗎？他們通過一系列的指標(biāo)，比如基因表達(dá)譜，分化潛能等，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在相當(dāng)大的程度上與胚胎干細(xì)胞相似。

2006年Shinya報道了小鼠誘導(dǎo)干細(xì)胞，引起科學(xué)界轟動[13]；2007年，他在人的細(xì)胞中同樣實現(xiàn)了細(xì)胞命運的逆轉(zhuǎn)，科學(xué)界沸騰了[14]。

展望

回過頭來，種種不可能，Shinya

怎么就幸運地成功了呢？現(xiàn)在通過更多的研究，我們知道，干細(xì)胞特性的維持是由一個基因網(wǎng)絡(luò)來共同作用的，通過上調(diào)某些關(guān)鍵基因就可以重建這個網(wǎng)絡(luò)，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的命運；山中伸彌最后鑒定的四個因子也不是必需的，用24個因子以外的其他因子進(jìn)行組合可以達(dá)到同樣的目的。這好比是一張大網(wǎng)，你只要能撐起其中的幾個支點，就可以把整張網(wǎng)撐起來。

iPS的發(fā)現(xiàn)有著不同尋常的意義。首先，它更新了人們的觀念，從此之后人們不再認(rèn)為細(xì)胞的命運不可逆轉(zhuǎn)，不單可以逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞其實還可以實現(xiàn)不同組織間的轉(zhuǎn)分化（Transdifferentiation）。其次，iPS細(xì)胞繞過了胚胎干細(xì)胞的倫理困境，很多實驗室都可以重復(fù)這個簡單的實驗得到iPS，開展多能干細(xì)胞的研究。其三，iPS細(xì)胞具有很多胚胎干細(xì)胞所沒有的優(yōu)勢：來自于病人自身的iPS細(xì)胞體外操作后重新植入病人體內(nèi)，免疫反應(yīng)將大大減少；如果將病人的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為ips細(xì)胞，在體外分化觀察在這個過程中出現(xiàn)的問題，就可以實現(xiàn)在培養(yǎng)皿里某種程度上模擬疾病的發(fā)生；疾病特異的iPS在體外擴增和分化以后，還可以用于篩選治療該疾病的藥物，或者對藥物的毒性進(jìn)行檢測（圖3）。

采自病人的少量成體細(xì)胞被逆分化成iPS細(xì)胞后，能夠在體外增殖，改造，分化成組織特異性的功能細(xì)胞。這些功能細(xì)胞重新植入人體可以幫助/取代受損的或者得病的器官/組織。iPS或者這些功能細(xì)胞也可以作為疾病模型用于一些藥物的篩選和毒性測試（圖片來自諾貝爾獎網(wǎng)站）。

但是這僅僅是新的開始，生命科學(xué)如此復(fù)雜和不可預(yù)測，要把這些愿景變成現(xiàn)實，讓iPS真正造福人類，這其中還有重重的困難。Shinya Yamanka，這位科學(xué)的寵兒，懷著最初幫助更多病人的理想，無畏地踏上了新的征程。

（注明：作者本人并非研究iPS，所以出現(xiàn)一些錯誤在所難免，歡迎指正。）

（本文主要參考了Shinya Yamanaka在NIH的講座：https：//videocast.nih.gov/Summary.asp？File=15547）

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