郭凱，趙曉燕，周紅姿，陳凱，李紀(jì)順，陳泉，楊合同

(山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

導(dǎo)向治療是一種有望代替化療的新的治療手段，應(yīng)用免疫毒素或?qū)蚨舅厥菍?shí)現(xiàn)導(dǎo)向治療的一個(gè)重要的發(fā)展方向，通過特異性抗體或細(xì)胞因子、激素等與毒素連接，前者作為導(dǎo)向部分即配體，可以引導(dǎo)分子到達(dá)腫瘤部位并與腫瘤細(xì)胞表面過量表達(dá)的該種受體結(jié)合;后者作為毒素部分，即殺滅腫瘤細(xì)胞的部分。部分免疫毒素，如 OVB3－PE、IgG－HD37－dgA、IgG－RFB4－dgA、B3－PE40、LHRH－PE40 等已進(jìn)入臨床觀察，DAB389－IL－2(商品名為ONTAC)已通過FDA批準(zhǔn)上市，顯示出良好的療效［1］。

綠膿桿菌外毒素A屬于單轉(zhuǎn)移酶家族，將NAD+的ADP－核糖基轉(zhuǎn)移至底物使其ADP－核糖化［2－3］。綠膿桿菌外毒素A(PEA)的分子量為66.0 kD，主要功能結(jié)構(gòu)域包括:Domain Ia(AA 1－252)，與受體識(shí)別的結(jié)合的結(jié)構(gòu)域;Domain Ib(AA 365－484);Domain II(AA 253－364)，Domain II與毒素從細(xì)胞膜外到細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān);Domain III(AA 405－613)，Domain III和Ib共同組成催化ADP－核糖化的催化結(jié)構(gòu)域。在真核細(xì)胞內(nèi)，綠膿桿菌外毒素A催化蛋白質(zhì)延長(zhǎng)因子eEF－2ADP，使其發(fā)生核糖基化作用從而喪失活性，最終阻斷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［2－3］。

人促性腺激素釋放激素(GnRH)做為重組蛋白的導(dǎo)向部分，能夠和癌細(xì)胞表面表達(dá)的GnRH受體特異性結(jié)合。大量實(shí)驗(yàn)表明，GnRH受體在某些癌細(xì)胞表面高度表達(dá)，而相應(yīng)的正常細(xì)胞表面該受體幾乎不表達(dá)［4－5］。

有文獻(xiàn)報(bào)道PE毒素的AA 359－365缺失后，PE的活性會(huì)大幅度提高［6］;此外，將PE末端5個(gè)氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL后，也會(huì)使其活性大幅度提高［7］。所以本文選取PEA衍生物PE39KDEL作為靶向抗腫瘤蛋白的毒素部分。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的PEA衍生物的相關(guān)基因工程蛋白中，都是以包涵體形式表達(dá)［8－9］，純化后需要進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性操作，然而蛋白質(zhì)的復(fù)性過程較為繁瑣，且無法保證蛋白質(zhì)的天然活性構(gòu)象［10－11］。本文通過表達(dá)載體的構(gòu)建和后期表達(dá)優(yōu)化，最終得到可溶性表達(dá)的蛋白GnRH－PE39KDEL前體，經(jīng)一步純化后蛋白純度達(dá)到95%以上，蛋白最終得率在2.6 mg/g菌體，解決了GnRH－PE39KDEL重組蛋白無法可溶表達(dá)的難題，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，質(zhì)粒pET－24b購(gòu)自Navogen公司，基因GnRH－PE39KDEL和相關(guān)引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.1.2 試劑

Pfu Taq DNA聚合酶購(gòu)自天為時(shí)代;限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司;IPTG購(gòu)自羅氏;蛋白質(zhì)中等分子量marker、卡那霉素、凝膠電泳回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司;HisTrap HP(通用電器生命科學(xué)部);其它為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 儀器

PCR儀:Bio－Rad MyCycler溫度梯度PCR儀。

電泳及成像:Bio－Rad和G－BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)。

蛋白質(zhì)純化及電泳:GE公司的AKTA purifier親和層析系統(tǒng)，Bio－Rad SDS－PAGE垂直電泳系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 GnRH－PE39KDEL 基因的獲得

依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化GnRH－PE39KDEL核酸序列，通過基因合成的方法，獲得全長(zhǎng)序列，由上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 pET－24b－GnRH－PE39KDEL 載體的構(gòu)建和鑒定

含GnRH－PE39KDEL全長(zhǎng)的Puc57的DH5α大腸桿菌經(jīng)質(zhì)?；厥赵噭┖刑崛⊥暾|(zhì)粒作為PCR模板。設(shè)計(jì)的正向引物含有蛋氨酸起始密碼子及 NdeI酶切位點(diǎn)，pET－24bForward:5′－ggaattc CATATGGAACACTGGTCTTACGGTC;反相引物中引入Factor Xa蛋白酶切割位點(diǎn)及EcoR I酶切位點(diǎn)，pET－24b Reverse:5″－ccgGAATTCGCGACCTTCCACCAGTTCGTCTTTCGGCGG。用Nde I和EcoR I限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR－GnRH－PE39KDEL回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pET－24b，兩者按摩爾比5:1混勻，使用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物1 μL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含卡那霉素的瓊脂糖平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆搖菌，提取質(zhì)粒比較重組DNA分子量大小，限制性內(nèi)切酶、PCR鑒定后進(jìn)行重組質(zhì)粒的測(cè)序，將陽性克隆命名為 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DH5α。

1.2.3 pET－24b－GnRH－PE39KDEL表達(dá)載體轉(zhuǎn)化及在不同大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

將鑒定后的 pET－24b－GnRH－PE39KDEL表達(dá)載體轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細(xì)胞株 BL21(DE3)和 BL21(DE3)plysS 中，分別記為 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DE3 和 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－plysS。

誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間:挑取 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DE3單菌落于 20mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)，按4%的接菌量轉(zhuǎn)接至50mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)3 h至 OD600為 0.6，加入異丙基－β－D－硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度 0、0.1、0.2、0.4、0.8mmol/L，分成 2 組，分別于30℃、37℃ 180 r/min培養(yǎng)5 h，每1 h取樣一次。菌液12000 g離心2 min，使用1×loading buffer重懸菌體，99℃保溫4 min，12000g離心2 min后－20℃保存待用。

宿主菌優(yōu)化:挑取 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－DE3 和 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－plysS 單菌落于 20mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2% 葡萄糖液體培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)，按4%的接菌量轉(zhuǎn)接至50mL含有100μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)3 h至OD600為0.6，IPTG至終濃度0.2 mmol/L，分成2組，于30℃ 180 r/min培養(yǎng)5 h，每 1 h取樣一次。菌液12000 g離心2 min，使用1×loading buffer重懸菌體，99℃保溫4 min，12000g離心2 min后－20℃保存待用。

1.2.4 變性 SDS－PAGE 電泳分析

配制12 mg/mL的分離膠和5 mg/mL濃縮膠，進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析蛋白表達(dá)。

1.2.5 GnRH－PE39KDEL融合蛋白的大量表達(dá)和初純品的制備

接種單克隆 pET－24b－GnRH－PE39KDEL－plysS 含有100 μmol/L 卡那霉素的 LB+0.2 mg/mL 葡萄糖液體培養(yǎng)基中37℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)，按5(V/V)接菌量接種種子液至500mL含有100 μmol/L卡那霉素的LB+0.2 mg/mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，約2.5 h OD600升為0.6時(shí)，降溫至30℃ 加入IPTG至終濃度0.2 mmol/L，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)2 h，高速離心收集菌體，按照菌體和破碎緩沖液(50mmol/L Tris pH=8.0，0.5 mol/L NaCl，5%Glycerol，20mmol/L Imidazole)1:5(V/V)的比例重懸菌體，超聲波破碎，高速離心后收集上清。加入1 μg/mL DNase和RNase及1 mmol/L MgCl2，經(jīng)0.22 μm 過濾膜過濾。

利用GE AKTA purifier系統(tǒng)平衡層析柱后，使用上樣泵將樣品加載入親和層析柱上(流速≤4 mL/min，柱壓≤0.3 MPa)。使用上樣緩沖液(50mmol/L Tris pH=8.0，0.5 mol/L NaCl)沖洗層析柱至 UV280達(dá)到平衡。調(diào)節(jié)洗脫緩沖液(50mmol/L Tris pH=8.0，0.5 mol/L NaCl，500mmol/L Imidazole)的體積至 10%(50mmol/L Imidazole)，洗脫結(jié)合在層析柱中的雜蛋白，設(shè)定UV280≥100收集。提高洗脫緩沖液體積比至50%(250mmol/L Imidazole)，最后使用100%(V/V)洗脫緩沖液清洗層析柱［12－13］。層析柱平衡后保存至緩沖液中，將各組分進(jìn)行SDS電泳分析。

1.2.6 活性檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞A549，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入200 μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至103～104個(gè)/孔。體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，孵育16～48 h。每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 pET－24b－GnRH－PE39KDEL 重組表達(dá)載體質(zhì)粒的鑒定

使用單克隆菌落回收的質(zhì)粒經(jīng) PCR、單酶切、雙酶切結(jié)果證實(shí)(圖1)，在pET－24b－GnRH－PE39KDEL載體中含有正確插入的重組蛋白核酸序列。

瓊脂糖電泳結(jié)果顯示在1.2 kb處有特異目的條帶，提取重組質(zhì)粒后使用BamHI、EcoRI進(jìn)行雙酶切，在5.3 kb和1.2 kb處獲得2個(gè)片段。經(jīng)生工生物工程(上海)有限公司正反向測(cè)序后，核酸序列與合成的重組蛋白核酸序列一致。

圖1 重組質(zhì)粒pET－24b－GnRH－PE39KDEL構(gòu)建的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoretic analysis of colony PCR products enzymatic digestion

2.2 pET－24b－GnRH－PE39KDEL表達(dá)產(chǎn)物的初步鑒定及表達(dá)條件的優(yōu)化

融合蛋白表達(dá)含有395個(gè)氨基酸殘基，理論分子量為42.8 kD。重組菌株中總蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳顯示在35～45 kD處有一明顯的目的條帶，同時(shí)在0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度下，蛋白表達(dá)達(dá)到最大值，增加IPTG并未增加誘導(dǎo)蛋白表達(dá)量(數(shù)據(jù)未列出)。在溫度誘導(dǎo)條件下，37℃蛋白表達(dá)量較30℃明顯增高，但是為包涵體表達(dá)形式，30℃時(shí)蛋白以可溶形式表達(dá)。故使用30℃進(jìn)行重組蛋白大量生產(chǎn)。在IPTG誘導(dǎo)下，重組蛋白在BL21(DE3)plysS中2 h達(dá)到最大表達(dá)量，而在BL21(DE3)此過程需要4 h(圖2)。BL21(DE3)plysS帶有的pLysS質(zhì)粒編碼T7噬菌體溶菌酶，可以極大或完全抑制誘導(dǎo)劑(IPTG)加入前的重組蛋白的非誘導(dǎo)表達(dá)，而重組蛋白在菌體生長(zhǎng)中的痕量表達(dá)有可能對(duì)IPTG誘導(dǎo)的蛋白過程起到一定的反饋抑制作用，這可能是BL21(DE3)plysS表達(dá)重組蛋白速度更快的原因。

使用Image Pro Plus對(duì)SDS－PAGE的結(jié)果分析顯示，重組蛋白表達(dá)量占總蛋白的30%(w/w)左右，占可溶蛋白的40%(w/w)以上。

圖2 pET－24b－GnRH－PE39KDEL 在 E.coli BL21(DE3)和 E.coli BL21(DE3)plysS 重組 SDS－PAGE電泳圖Fig.2 SDS－PAGE analysis of recombinant protein of pET－24b－GnRH－PE39KDEL in E.coli BL21(DE3)and E.coli BL21(DE3)plysS

2.3 重組蛋白純品的制備

經(jīng)過HisTrap親和層析柱純化得到的蛋白純度約為90%，使用脫鹽柱緩沖液置換后，去除了小分子量的蛋白和一些線性蛋白，蛋白純度達(dá)到95%以上，見圖3。蛋白純化過程中存在一些可以和鎳柱親和吸附的宿主菌蛋白，在圖3中可見在25～30 kD有宿主蛋白條帶。在后續(xù)的純化過程中，這些非特異性吸附蛋白被去除掉(數(shù)據(jù)未列出)。

圖3 重組蛋白純化過程與SDS－PAGE電泳結(jié)果Fig.3 Purification of recombinant protein GnRH－PE39KDEL

2.4 質(zhì)譜鑒定重組蛋白氨基酸序列

取蛋白樣品 200 μg，溶于 50 μL 含有 8mol/L urea、10mmol/L DTT、50mmol/L NH4HCO3的溶液中，置37°C水浴中還原4 h，然后加入5 μL 0.5 mol/L碘乙酰胺放置暗處1 h進(jìn)行烷基化，加250 μL 50mmol/L NH4HCO3溶液將尿素稀釋到1 mol/L以下，最后加入5 μg的胰蛋白酶37℃保溫反應(yīng)16 h，取出后冷凍干燥成粉末，用流動(dòng)相(體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液)復(fù)溶至200 μL待測(cè)。

使用Agilent串聯(lián)快速分離液相－6520型四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(RRLC－Q－TOF)鑒定，肽段和數(shù)據(jù)庫比較得出，此蛋白含有正確的PEA66蛋白序列。由于重組蛋白是一種毒性蛋白，在大腸桿菌中是否表達(dá)，是否表達(dá)全長(zhǎng)序列需要檢測(cè)。通過質(zhì)譜分析并結(jié)合SDS電泳分析發(fā)現(xiàn)，在宿主菌中重組蛋白得以表達(dá)并且可以全長(zhǎng)正確表達(dá)，結(jié)果圖4所示。

2.5 重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的增值抑制效果

本實(shí)驗(yàn)室前期得到的包涵體蛋白復(fù)性后的活性檢測(cè)結(jié)果表明，包涵體復(fù)性蛋白活性明顯低于可溶性表達(dá)的重組蛋白。同時(shí)包涵體復(fù)性過程不僅增加了操作步驟和生產(chǎn)成本，同時(shí)由于操作步驟過多降低了蛋白的得率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示可溶性表達(dá)重組蛋白對(duì)于肺癌細(xì)胞株A549的增殖有很好的抑制作用，經(jīng)計(jì)算IC50所需要的重組蛋白濃度為 20.70 μg/mL，相對(duì)應(yīng)的包涵體復(fù)性蛋白濃度為192.42 μg/mL。由此可見可溶性表達(dá)的重組蛋白具有很好的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

2.6 討論

目前以GnRH或其衍生物為導(dǎo)向部分，以綠膿桿菌外毒素A(PE)的截短形式及其衍生物為毒素部分的靶向治療劑已經(jīng)有報(bào)道［14］。這種靶向治療劑是利用GnRH受體在某些腫瘤細(xì)胞表面過量表達(dá)的現(xiàn)象，用融合蛋白中的GnRH部分與過度表達(dá)GnRH受體的腫瘤細(xì)胞表面的LHRH受體產(chǎn)生特異性的結(jié)合，然后將其毒素部分PE衍生物導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞作用較少或無影響。與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法相比GnRH－PE衍生物的靶向性治療以其特異性和高效性而占有無可爭(zhēng)辯的優(yōu)勢(shì)［15－17］。

在已有的PE類衍生物的重組蛋白報(bào)道中，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，這為后期蛋白復(fù)性和工業(yè)化生產(chǎn)帶來很多問題。本研究構(gòu)建的pET－24b－GnRH－PE39KDEL－BL21(DE3)plysS能夠?qū)崿F(xiàn)重組蛋白的可溶性表達(dá)，在對(duì)重組蛋白表達(dá)條件進(jìn)行初步優(yōu)化后，利用AKTA purifier系統(tǒng)可以獲得純度達(dá)95%以上的目的蛋白，蛋白最終得率在2.6 mg/g菌體。并且通過IC50檢測(cè)，證實(shí)了前體蛋白良好的毒殺腫瘤細(xì)胞活性。

本實(shí)驗(yàn)通過工程菌株的篩選和優(yōu)化表達(dá)純化工藝，得到了一套較為成熟和簡(jiǎn)便的GnRH－PE39KDEL純化流程，為后續(xù)工業(yè)放大生產(chǎn)奠定了可靠的基礎(chǔ)。

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