徐美霞，王曉，劉建華，耿巖玲，王岱杰，劉峰*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山東 泰安，271000;2.山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014)

干姜是姜科植物Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，具有溫中散寒，回陽(yáng)救逆，燥濕消痰的功效，中醫(yī)常用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微和痰飲喘咳等癥［1］。姜酚是姜中主要的辣味和生物活性成分，主要有 6－姜酚、8－姜酚、10－姜酚、6－姜烯酚、8－姜烯酚以及 10－姜烯酚等［2－3］。研究表明，姜酚具有健胃與抗胃潰瘍、保肝利膽、抗血小板聚集、降血脂、抗動(dòng)脈硬化、抗缺氧和保護(hù)心肌細(xì)胞等作用［4－6］。姜酚化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易氧化，見(jiàn)光受熱易分解，且在姜中含量低，不易分離，到目前為止還沒(méi)有較理想的姜酚合成方法，因此建立相關(guān)成分的分離純化方法對(duì)干姜藥效研究及質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。

高速逆流色譜(HSCCC)是一種液液分配分離技術(shù)，不需要任何載體或支撐體作為固定相，排除了對(duì)樣品的不可逆吸附、沾染、變性、失活等影響，而且具有操作簡(jiǎn)單、分離量大、分離時(shí)間短、樣品易回收、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離制備［7－9］。本實(shí)驗(yàn)建立了高速逆流色譜結(jié)合硅膠柱色譜法分離干姜中6－姜酚、8－姜酚、6－姜烯酚的方法，不僅簡(jiǎn)便快捷，而且所得產(chǎn)物純度高、制備量大、分離效率高，可為干姜資源的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料、儀器與試劑

儀器:GS10A高速逆流色譜儀(北京新技術(shù)研究所);HF－10B超聲循環(huán)提取儀(北京弘祥隆生物技術(shù)有限公司);Waters 600高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司，配PDA檢測(cè)器);Varian INOVA－600核磁共振波譜儀(美國(guó)Varian公司);Agilent 5973N質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R－3(瑞士BUCHI公司);HH－4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);硅膠G(200～300目)、薄層用硅膠板(青島海洋化工廠)。

試劑:石油醚、甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸為分析純(天津廣成化學(xué)試劑有限公司);粗提物的制備及逆流色譜分離所用溶劑均為分析純(濟(jì)南巨業(yè)化學(xué)試劑有限公司)，HPLC分析用甲醇、乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司);水為二次蒸餾水。

材料:干姜購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為姜科姜屬植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的干燥根莖。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的提取

干姜粉碎后過(guò)60目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0kg于超聲循環(huán)提取儀中，加入10 L乙酸乙酯，超聲提取40min，抽濾，減壓蒸餾回收乙酸乙酯，重復(fù)提取3次，蒸干溶劑得到干姜浸膏。

2.2 硅膠柱色譜分離

取上述干姜浸膏，用硅膠柱色譜法進(jìn)行分離，以石油醚－乙酸乙酯梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測(cè)，合并相同組分得到A1～A6六段餾分，選取A3和A4兩個(gè)餾分進(jìn)行高速逆流色譜分離。

2.3 兩相溶劑體系和樣品溶液的制備

A4餾分所用高速逆流色譜溶劑體系為石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶0.8∶0.7，V/V);A3餾分所用高速逆流色譜溶劑體系為石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶1∶0.5，V/V)。分別將其按比例配制于分液漏斗中并劇烈震蕩使其混合均勻，靜置分層，上層為固定相，下層為流動(dòng)相。

分別稱(chēng)取A4餾分400mg，A3餾分220mg，并分別加入5 mL上相、5 mL下相超聲溶解，以備逆流色譜分離用。

2.4 高速逆流色譜分離

首先將固定相以9 mL/min流速充滿逆流色譜分離柱，然后開(kāi)啟速度控制器使逆流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)達(dá)到800 r/min，以2 mL/min流速泵入流動(dòng)相，直至下相流出，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，將溶解的樣品通過(guò)進(jìn)樣器注入色譜柱，在254 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)色譜峰。

2.5 高效液相色譜條件

高效液相色譜條件:Inertsil C18色譜柱(250mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A:甲醇，流動(dòng)相B:冰乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%);等度洗脫:0～25 min，A:75%，B:25%;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):279 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇/水、乙腈/水，甲醇/冰乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%)，乙腈/冰乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%)等多個(gè)流動(dòng)相體系對(duì)樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果表明，甲醇/冰乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%)體系出峰時(shí)間合適，各個(gè)峰能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離。最終采用甲醇/冰乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)0.2%)(二者體積比75:25)對(duì)樣品進(jìn)行分析，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

3.2 逆流色譜的溶劑系統(tǒng)優(yōu)化

選擇合適的兩相溶劑系統(tǒng)是逆流色譜分離純化天然植物中活性成分的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)所分離化合物的特性，考察了不同體系氯仿－甲醇－水、乙酸乙酯－甲醇－水、石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水對(duì)目標(biāo)化合物的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用氯仿－甲醇－水，乙酸乙酯－甲醇－水體系時(shí)化合物難以完全分離，因此選擇石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水作為溶劑系統(tǒng)，上相作為固定相，下相為流動(dòng)相。根據(jù)A3餾分中目標(biāo)化合物的極性，首先試用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶0.9∶0.6，V/V)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)化合物雖然達(dá)到基線分離，但出峰時(shí)間比較靠后，分離時(shí)間較長(zhǎng)，因此調(diào)整甲醇/水的比例，增加化合物在流動(dòng)相中的分配，于是將系統(tǒng)調(diào)整為石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶1∶0.5，V/V)，縮短分離時(shí)間。根據(jù)A4餾分中目標(biāo)化合物的極性首先試用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水(1∶0.5∶0.9∶0.6，V/V)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)化合物雖然呈現(xiàn)分開(kāi)的趨勢(shì)，但未達(dá)到基線分離，說(shuō)明化合物在下相中的分配多，因此調(diào)整甲醇/水的比例，減少化合物在下相的分配，于是將系統(tǒng)調(diào)整為石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶0.8∶0.7，V/V)，使各化合物得到良好的分離。

3.3 高速逆流色譜分離純化

以石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶0.8∶0.7，V/V)作為 A4 餾分的分離體系，一次性進(jìn)樣400mg，分離時(shí)間180min，固定相保留率為72.7%，逆流色譜圖如圖2所示，主要得到A和B兩個(gè)化合物，分別進(jìn)行HPLC 分析，用面積歸一化法測(cè)得其純度為99.63%、98.32%。其質(zhì)量分別為63.80mg、22.36 mg。

以石油醚 － 乙酸乙酯 － 甲醇 － 水(1∶0.5∶1∶0.5，V/V)作為 A3 餾分的分離體系，一次性進(jìn)樣220mg，分離時(shí)間300min，固定相保留率為62.5%，逆流色譜圖如圖3所示，主要得到化合物C，進(jìn)行HPLC分析，用面積歸一化法測(cè)得其純度為98.02%。其質(zhì)量為29.46 mg。

3.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 A:ESI－MS(m/z):317［M+Na］+，293［M－H］﹣.1H NMR(CDCl3，600mHz):δ 6.60 ～6.80(3H，m，H ～2′，5′，6′)，6.05(1H，brs，－OH)，4.00(1H，m，－OH)，3.82(3H，s，－OCH3)，2.71 ～2.82(2H，m，H－1)，2.57(2H，m，H－4)，2.46(2H，t，J=7.2 Hz，H－5)，1.22 ～1.68(8H，m，H－6，H－7，H－8，H－9)，0.87(3H，t，J=7.2 Hz，－CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對(duì)照一致，鑒定為6－姜酚。

化合物 B:ESI－MS(m/z):345［M+Na］+，321［M－H］﹣.1H NMR(CDCl3，600mHz):δ 6.63 ～ 6.83(3H，m，H－2′，5′，6′)，5.64(1H，brs，－OH)，4.01(1H，m，－OH)，3.86(3H，s，－OCH3)，3.00(1H，brs，OH)，2.81(2H，t，J=7.2 Hz，H－1)，2.45(2H，t，J=7.2 Hz，H－2)，1.27 ～1.50(14H，m，H－5，6，7，8，9，10，11)，0.86(3H，t，J=7.2 Hz，－CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］對(duì)照一致，鑒定為8－姜酚。

化合物 C:ESI－MS(m/z):299［M+Na］+，275［M－H］﹣.1H NMR(CDCl3，600mHz):6.80(1H，d，J=13.5 Hz，H－5)，6.70(1H，d，J=1.8 Hz，H－2′)，6.65(1H，dd，J=6.2 Hz，H－6′)，6.05(1H，d，J=14.5 Hz，H－4)，3.82(3H，s，－OCH3)，2.83(4H，m，H－1，H－2)，2.17(2H m，H－6)，1.41(2H，m，H－7)，1.29(4H，m，H－8，H－9)，0.87(3H ，t，J=7.1 Hz，H－10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］對(duì)照一致，鑒定為6－姜烯酚。

4 討論

姜酚是干姜的重要活性成分，其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備對(duì)干姜的質(zhì)量評(píng)價(jià)和相關(guān)的藥理研究具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用硅膠柱色譜結(jié)合高速逆流色譜法從干姜提取物中分離得到了純度大于98%的6－姜酚、8－姜酚、6－姜烯酚，具有純度高、制備量大、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，對(duì)天然產(chǎn)物活性成分的快捷有效制備具有參考價(jià)值。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:13－14.

［2］姜子濤，李榮.姜辣素化學(xué)及其研究進(jìn)展［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，1998，19(1)):7－10.

［3］盧傳堅(jiān)，歐明，王寧生.姜的化學(xué)成分分析研究概述［J］.中藥新藥與臨床藥理，2003，14(3):215－217.

［4］FENG L，WANG Y L，PARKIN K L，et al.Isolation of quinone reductase(QR)inducing agents from ginger rhizome and their in vitro anti－inflammatory activity［J］.Food Research International，2011，44(6):1597 － 1603.

［5］崔儉杰，李瓊，金其璋，等.生姜及其提取物研究進(jìn)展［J］.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，9(3):229－234.

［6］胡煒彥，張榮平，唐麗萍，等.生姜化學(xué)和藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2008(9):10－13.

［7］YANAGIDA A，YAMAKAWA Y，NOJI R，et al.Comprehensive separation of secondary metabolites in natural products by highspeed counter－current chromatography using a three－phase solvent system［J］.Journal of Chromatography A，2007，1151(1/2):74－81.

［8］王祖林，韓利文，劉秀河，等.高速逆流色譜在天然產(chǎn)物有效成分分離中的應(yīng)用［J］.山東科學(xué)，2009，22(3):44－49.

［9］LIU Y Q，GUO X F，DUAN W J，et al.Accelerated solvent extraction of monacolin K from red yeast rice and purification by highspeed counter－current chromatography［J］.Journal of Chromatography B，2010，878(28):2881 －2885.

［10］WANG X，ZHENG Z J，GUO X F，et al.Preparative separation of gingerols from Zingiber of cinale by high－speed counter－current chromatography using stepwise elution［J］.Food Chemistry，2011，125(4):1476 －1480.

［11］包磊，鄧安珺，李志宏，等.姜的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(5):598－601.