劉曉鵬，姜 寧 *，劉志彪

（1.湖北民族學(xué)院 科技學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

淫羊藿屬小蘗科（Berberidaceae）淫羊藿屬（Epimedium）植物，主要分布于亞洲、中東、和歐洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)，其中80%分布在中國，一般生長在林下、灌木叢中或陰濕的地方，海拔200m～3700m之間的地區(qū)。中國藥典2005版、2010版均收載該植物為藥用植物[1]，2010版《中國藥典》一部中有龜鹿補(bǔ)腎丸、抗骨增生丸、抗骨增生膠囊等多個(gè)常用中成藥的主要原料藥均含淫羊藿[1]。

淫羊藿屬植物的化學(xué)成分主要為黃酮類、多糖、木脂素類、酚苷類、紫羅酮類、倍半萜類、苯乙醇苷類、生物堿類等；淫羊藿多糖具有激活巨噬細(xì)胞T和B淋巴細(xì)胞以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、促進(jìn)干擾素的合成、增強(qiáng)機(jī)體抗菌、抗腫瘤、降低血糖和血脂、抗衰老、抗艾滋病病毒（HIV）、抗疲勞、抗凝血、消除自由基、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及恢復(fù)機(jī)體放化療后的免疫功能等藥理作用，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)造血功能和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效[2-3]。傳統(tǒng)的中藥中，對(duì)淫羊藿葉多糖的提取方法是以水煎劑形式的水提法，其提取結(jié)果成分不明確，有效成分含量含糊不清。進(jìn)行淫羊藿葉多糖的提取研究是進(jìn)一步明確淫羊藿葉多糖的組成、結(jié)構(gòu)及功能的基礎(chǔ)。本研究對(duì)淫羊藿葉多糖超聲提取的方法進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步對(duì)該成分進(jìn)行藥理研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

淫羊藿葉：由恩施隆鑫中藥材公司提供，60℃烘干，粉碎，過60目篩；標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、蒽酮、正丁醇、95%vol乙醇為分析純，濃硫酸、氯仿為化學(xué)純。

1.2 儀器

JY96-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；紫外分光光度計(jì)；水浴鍋；離心機(jī)等。

1.3 方法

1.3.1 水浴提取淫羊藿葉多糖

采用正交試驗(yàn)水浴提取淫羊藿葉多糖，選取影響水浴提取效果的4個(gè)因素：料液比、水浴溫度、水浴時(shí)間、pH值，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，采用L9（34）正交表，試驗(yàn)數(shù)為9（試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表見表1）。

稱取1g淫羊藿干粉，加入不同pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸緩沖液，按不同因素水平水浴提取，然后離心取上清液，加入3倍體積的乙醇，靜置于4℃冰箱2h；離心（轉(zhuǎn)速5000r/min，時(shí)間10min），取沉淀，加10mL蒸餾水溶解；Sevag法除蛋白，取上清液，加水稀釋5倍。取樣，用蒽酮比色法測(cè)量淫羊藿葉多糖的含量。

表1 水浴提取因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction

1.3.2 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖

稱取1g淫羊藿干粉，加入不同pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸緩沖液，進(jìn)行超聲波處理，離心取上清液，加3倍體積的乙醇，靜置于4℃冰箱中24h；離心（轉(zhuǎn)速5000r/min，時(shí)間10min），取沉淀，加10mL蒸餾水溶解；Sevag法除蛋白，取上清液，加水稀釋5倍。取樣用硫酸-蒽酮比色法[4]測(cè)量淫羊藿葉多糖的含量。

選取不同的超聲波功率：40W、60W、80W、100W、120W進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲時(shí)間30min，料液比1∶80，pH8.0進(jìn)行單因素試驗(yàn)，多糖的測(cè)定按1.3.2的方法進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

選取不同的超聲時(shí)間：10min、20min、30min、40min進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲功率是60W、料液比1∶80，pH8.0進(jìn)行單因素試驗(yàn)，多糖的測(cè)定按1.3.2的方法進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

選取不同的料液比：1∶20、1∶40、1∶60、1∶80進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲功率60W、時(shí)間30min，pH8.0進(jìn)行單因素試驗(yàn)，多糖的測(cè)定按1.3.2的方法進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

選取不同的pH值：5.5、6.0、7.0、8.0、8.5進(jìn)行單因素試驗(yàn)，超聲功率60W、時(shí)間30min，料液比1∶80進(jìn)行單因素試驗(yàn)，多糖的測(cè)定按1.3.2的方法進(jìn)行。試驗(yàn)重復(fù)3次。

為了綜合研究以上4個(gè)因素對(duì)淫羊藿葉多糖提取效果的影響，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 超聲輔助提取因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

1.3.3 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖與水浴提取效果的比較

根據(jù)正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取超聲輔助提取的最佳工藝與水浴提取的最佳工藝進(jìn)行淫羊藿葉多糖的提取，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)10次以比較二者的提取效果。試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 16.0 軟件包分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴提取淫羊藿葉多糖的結(jié)果與分析

由水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果得知（表3）：4個(gè)影響水浴提取因素的主次順序?yàn)榱弦罕龋舅囟龋緋H值＞水浴時(shí)間；水浴提取淫羊藿葉多糖的最佳工藝是A3B1C2D3，即料液比為1∶80、水浴時(shí)間60min、水浴溫度80℃、浸出液的pH值為8.0。

表3 水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Result of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by hot water

表4 水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal extracting test for polysaccharides extraction by hot water

對(duì)水浴提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表4），結(jié)果表明，料液比、時(shí)間、溫度和pH值這4個(gè)因素的F值分別為211.721、6.063、32.384和7.970，顯著水平均達(dá)到p＜0.05，說明這4個(gè)因素均能顯著影響試驗(yàn)結(jié)果。比較4個(gè)因素的F值，同樣可以得出各因素的主次順序料液比＞水浴溫度＞pH值＞水浴時(shí)間，這與上述分析一致。

2.2 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的結(jié)果與分析

2.2.1 超聲功率單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

超聲功率單因素試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，當(dāng)超聲功率為100W時(shí)，淫羊藿葉多糖提取率平均達(dá)2.25%，為最高值，隨著超聲功率進(jìn)一步加大，多糖的提取率不再升高反而下降。對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表6），F(xiàn) crit為顯著水平達(dá)0.05時(shí)的F臨界值，即F0.05（4，10），由于F＞F crit，可以看出超聲輔助有助于淫羊藿葉多糖的提取。

表5 超聲功率單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of single factor test on the ultrasonic intensity

表6 超聲功率單因素試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of single factor test on the ultrasonic intensity

2.2.2 超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

從超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果（表7）可知，當(dāng)超聲時(shí)間從10min延長至20min時(shí)，超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的量并未顯著增加，當(dāng)從20min延長至30min時(shí)，多糖提取量增加顯著，當(dāng)超聲時(shí)間進(jìn)一步延長時(shí)，多糖提取的數(shù)量又開始下降。對(duì)超聲單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表8），可以得知F.＞F crit，也就是大于顯著水平為0.05時(shí)的F臨界值，表明超聲時(shí)間這個(gè)因素對(duì)淫羊藿葉多糖提取的影響達(dá)顯著水平。

表7 超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Result of single factor test on the ultrasonic time

2.2.3 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

表9的料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然料液比為1∶80時(shí)多糖含量最高，但用LSD法對(duì)不同料液比處理間的進(jìn)行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)料液比1∶80與1∶60時(shí)無顯著差異，所以最佳料液比應(yīng)為1∶60；方差分析（表10）結(jié)果表明，F(xiàn)值大于顯著水平為0.05時(shí)的F臨界值（F crit），說明料液比能顯著影響超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率。

表8 超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of single factor test on the ultrasonic time

表9 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 9 Result of single factor test on the material/liquid ratio

表10 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of single factor test on the material/liquid ratio

2.2.4 pH值單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

從表11的pH值單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，浸提液在酸性至中性的范圍內(nèi)，超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率逐步增大，當(dāng)浸出液為微堿性時(shí)（pH8.0），多糖的得率為最大值；當(dāng)浸出液pH值為8.5時(shí)，多糖的得率開始下降。對(duì)該數(shù)據(jù)的方差分析（表12）表明，F(xiàn)＞F crit（顯著水平為0.05時(shí)的F臨界值），也就是說pH值這個(gè)因素對(duì)超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率會(huì)產(chǎn)生顯著的影響。

表11 pH 值單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 11 Result of single factor test on the pH value

2.2.5 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果（表13）表明，各因素對(duì)超聲輔助提取淫羊藿葉多糖影響的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，最優(yōu)提取工藝是A2B3C1D2，也就是料液比1∶60、超聲功率100W、超聲時(shí)間10min、pH7.0。對(duì)此提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)重復(fù)10次，淫羊藿葉多糖的得率平均為2.27%。

表12 pH 值單因素試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 12 Variance analysis of single factor test on the pH value

表13 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果Table 13 Result of orthogonal test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

表14為超聲輔助提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析，從表14可以看出，料液比、超聲功率、超聲時(shí)間和pH值4個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響均達(dá)到顯著水平（p＜0.05），從它們的F值同樣可以得出如下結(jié)論：超聲輔助提取淫羊藿葉多糖影響因素的主次順序?yàn)榱弦罕龋緋H值＞超聲功率＞超聲時(shí)間。

表14 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 14 Variance analysis of orthogonal test for polysaccharides extraction by ultrasonic-assisted

2.3 超聲輔助提取淫羊藿葉多糖與水浴提取淫羊藿葉多糖效果的比較結(jié)果與分析

超聲輔助提取淫羊藿葉多糖采用通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)結(jié)果分析得出的最佳工藝：料液比1∶60、超聲功率100W、超聲時(shí)間10min、浸提液的pH7.0；水浴提取淫羊藿葉多糖采用通過正交試驗(yàn)結(jié)果分析得出的最佳工藝：料液比1∶80、水浴時(shí)間60min、水浴溫度80℃、浸出液的pH值為8.0。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)10次，結(jié)果為超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的得率為2.27%，而水浴提取為1.34%，多糖得率提高了68.70%。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)的差異顯著水平達(dá)0.01。說明了超聲輔助法提取淫羊藿葉多糖明顯優(yōu)于水浴法。

3 討論

通過超聲處理，淫羊藿葉細(xì)胞破裂，而且超聲波還具有機(jī)械振動(dòng)、乳化擴(kuò)散、擊碎等效應(yīng)，有利于植物中有效成分的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，這就使胞內(nèi)多糖較水浴浸提的釋放量要多得多，加大料液比可以提高多糖浸出的濃度差，使多糖盡快溶入浸出液中[5]。超聲功率與超聲處理時(shí)間的摸索，是為了研究最適合淫羊藿細(xì)胞破裂的超聲處理?xiàng)l件。

超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的單因素試驗(yàn)表明：超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、浸出液的pH值這4個(gè)因素對(duì)多糖提取效果均產(chǎn)生顯著影響，說明在超聲輔助提取淫羊藿葉多糖的工藝摸索中必須對(duì)這4個(gè)因素都應(yīng)加以考慮。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲功率為100W時(shí)就能使細(xì)胞最大程度的破裂，提高功率對(duì)提高得率并無幫助；在單因素試驗(yàn)中超聲波處理時(shí)間以30min為最優(yōu)，最佳的pH值為8.0，而在正交試驗(yàn)中超聲波處理時(shí)間以10min為最優(yōu)，最佳的pH值為8.0，說明4個(gè)因素需要優(yōu)化組合才能得到最優(yōu)的淫羊藿葉多糖提取工藝。

通過2種方法的比較試驗(yàn)證明了超聲輔助提取淫羊藿葉多糖明顯優(yōu)于水浴提取，多糖的得率提高了68.70%，并且超聲處理還具有省時(shí)（從60min縮短為10min）、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。這為工業(yè)化大生產(chǎn)提取淫羊藿葉多糖提供了有利的理論依據(jù)。

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