李繼來，陳忠云，李曉峰，李 婧，杜繼臣，楊 旭

缺血性腦卒中(IS)是由遺傳和環(huán)境等多種因素共同作用導(dǎo)致的一種多因素疾病[1]。傳統(tǒng)的危險因素如年齡、高血壓、糖尿病、高血脂、吸煙等很難完全解釋疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。研究表明，動脈粥樣硬化(AS)作為一種導(dǎo)致IS的主要病因，被認(rèn)為是一種炎性疾病[2-3]。C反應(yīng)蛋白(CRP)作為一種參與全身炎癥反應(yīng)的炎性標(biāo)志物[4]，參與了AS的發(fā)生、發(fā)展，能夠反映AS斑塊中的炎癥活動水平[5-7]，對IS的發(fā)病、嚴(yán)重程度及預(yù)后等有重要的預(yù)測價值[8-12]，可以作為預(yù)測老年人IS發(fā)病的標(biāo)記物。已有研究表明，CRP基因一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與IS密切相關(guān)[13-14]，但亦有爭議[15-16]?；诖耍狙芯繑M采用基于中國漢族人群的病例對照研究，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，觀察漢族IS患者和健康人群的基因多態(tài)性分布，探討CRP基因兩個SNP(rs1800947和rs3093059)位點與IS及其亞型的相關(guān)性,并進(jìn)一步研究CRP基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年10月—2011年12月連續(xù)收集入住航天中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的IS患者159例為病例組，其中男112例，女47例；平均年齡(65.4±8.2)歲。所有患者為發(fā)病5 d內(nèi)入選，IS診斷符合世界衛(wèi)生組織(WHO)卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除以下疾?。耗X腫瘤、腦血管畸形、代謝性疾病(糖尿病除外)、感染、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤和嚴(yán)重的慢性疾病(如肝、腎功能不全等)。同期從體檢中心隨機(jī)選取年齡、性別與病例組相匹配的健康者175例為對照組,其中男106例，女69例；平均年齡(65.8±8.6)歲。根據(jù)臨床分析和實驗室評估，按照病例組的篩選標(biāo)準(zhǔn)，同樣排除上述的腦腫瘤等疾病。所有受試者互不相關(guān)且均來自北京。本研究經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱韰f(xié)會和醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。所有患者簽署知情同意書。

1.2 資料收集 由同一位醫(yī)生對每例患者及對照者采用統(tǒng)一的調(diào)查問卷和詢問方式，包括現(xiàn)病史和既往史、體格檢查、實驗室檢查以及個人史〔體質(zhì)指數(shù)(BMI)、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史〕等。對所有患者行顱腦磁共振成像(MRI)和(或)顱腦CT、心臟超聲、頸外動脈雙重成像以及實驗室檢查，必要時行磁共振血管造影(MRA)以及多普勒超聲心動圖(PDE)。根據(jù)TOAST(the Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment)分型，排除其他病因引發(fā)的IS以及原因不明的IS，把病例組分為大動脈粥樣硬化(LAA)組、小動脈阻塞(SAA)組、心源性栓塞(CE)組。

1.3 定義 BMI=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)，BMI≥25 kg/m2為肥胖和(或)超重。高血壓指收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和(或)舒張壓≥90 mm Hg，或者接受高血壓藥物治療。糖尿病指有糖尿病的相關(guān)臨床癥狀，并且1 d當(dāng)中任意時候血糖水平≥11.1 mmol/L，或空腹至少8 h后，血糖水平≥7.0 mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)2 h血糖水平≥11.1 mmol/L。冠心病指既往有明確的心絞痛史、心肌梗死史。吸煙史指5年內(nèi)至少每天吸煙10支。飲酒史指平均每天飲白酒2兩以上，連續(xù)5年以上。腦卒中家族史指至少一個一級直系親屬曾患腦梗死。

1.4 基因多態(tài)性分析

1.4.1 DNA提取 IS患者入院次日及對照組受檢者體檢當(dāng)日清晨采集空腹肘靜脈血2 ml(EDTA抗凝)，用鹽析法[17]提取外周血白細(xì)胞中基因組DNA，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 標(biāo)簽SNP選擇 以NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中中國漢族人群的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選擇最小等位基因頻率(MAF)>18%的SNP或者已被報道的SNP為研究目標(biāo)位點，最終選擇了位于第二外顯子區(qū)的rs1800947和啟動子區(qū)的rs3093059。

1.4.3 引物設(shè)計及基因型的測定 應(yīng)用Premier 5.0軟件自行設(shè)計CRP rs1800947和rs3093059引物，并經(jīng)GENEBANK中BLAST分析其特異性高，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。(1)PCR反應(yīng)體系：20 μl反應(yīng)體系包括上下游引物各4 pmol，基因組DNA(鹽析法提取) 10 ng，2×PCR Mix〔天根生化科技(北京)有限公司，貨號：KT201〕10 μl，加水補足反應(yīng)體系。(2)PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。(3)酶切與電泳：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，加入限制性內(nèi)切酶10 U和2 μl內(nèi)切酶緩沖液混合，溫育過夜。以2%瓊脂糖凝膠對PCR酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，溴化乙錠0.5 mg/L染色，電泳緩沖液為0.5倍Tris-硼酸緩沖液(0.5×TBE)，選擇電泳電壓100 V(5 V/cm)，在紫外分析儀上觀察結(jié)果并照相，根據(jù)電泳后見到的條帶分析基因型(見表1)。

1.4.4 基因分析 rs1800947經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生663 bp片段，rs1800947 CC基因型者無Tsp45I酶切位點，酶切圖譜只見663 bp 1條帶；GG基因型者兩等位基因序列都發(fā)生G>C突變，出現(xiàn)Tsp45I酶切位點，酶切圖譜可見530 bp、104 bp 2條帶；GC雜合基因型者可見663 bp、530 bp、104 bp 3條帶，測序結(jié)果證實此位點發(fā)生G>C置換。rs3093059基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為285 bp，擴(kuò)增片段內(nèi)另有一個酶切位點。TT基因型(野生型)的擴(kuò)增產(chǎn)物可被完全切斷，主要可見178 bp、64 bp、53 bp 3種片段；TC基因型為雜合子，可見242 bp、178 bp、64 bp、53 bp 4種片段；CC基因型(突變純合子)不能被酶切斷，可見242 bp和53 bp 2種片段。測序結(jié)果證實此位點發(fā)生T>C置換。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組臨床資料比較 病例組較對照組冠心病史、高血壓史、糖尿病史、BMI≥25 kg/m2、吸煙史、飲酒史的檢出率增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組年齡、性別、三酰甘油、總膽固醇水平及腦卒中家族史比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表1 CRP基因引物序列、內(nèi)切酶和酶切片段長度

表2 對照組與病例組臨床資料比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)

2.2 病例組與對照組基因型和等位基因比較 rs1800947和rs3093059的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。一般人群中以上基因位點各等位基因已經(jīng)達(dá)到遺傳平衡，具有較好的人群代表性。

Logistic回歸校正相關(guān)混雜因素(性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史)后，病例組與對照組rs1800947 GG和GC基因型分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔OR=3.456，95%CI(1.350，8.845)，P=0.010〕。病例組與對照組rs1800947 G和C等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔OR=3.069，95%CI(1.237，7.612)，P=0.016〕。rs3093059基因型和等位基因分布與IS無相關(guān)性(見表3)。

Logistic回歸校正相關(guān)混雜因素后，rs1800947 GC基因型與SAA的發(fā)生有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)〔OR=6.225，95%CI(1.739，22.291)，P=0.005〕；rs3093059基因型與IS亞型無相關(guān)性(見表4)。

2.3 rs1800947與環(huán)境因素的交互作用 與rs1800947 GG基因型且無吸煙史、飲酒史的個體相比，rs1800947 GC基因型且有吸煙史以及飲酒史的個體患IS的風(fēng)險上升，校正相關(guān)危險因素后，OR值分別為6.667和11.110(見表5)。

表3 對照組與病例組rs1800947和rs3093059基因型和等位基因比較(例)

注：*多元Logistic回歸校正性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史

表4 病例組不同亞型與對照組rs1800947和rs3093059基因型和等位基因比較(例)

注：LAA=大動脈粥樣硬化，SAA=小動脈阻塞，CE=心源性栓塞;*多元Logistic回歸校正性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史、飲酒史和腦卒中家族史

表5 rs1800947與環(huán)境因素的交互作用分析(例)

注：*多元Logistic回歸校正性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、冠心病史以及腦卒中家族史

3 討論

炎癥機(jī)制參與了動脈粥樣硬化疾病諸如心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展[18-20]，CRP作為炎性標(biāo)志物其血清水平能夠有效預(yù)測心血管事件的發(fā)生。研究表明，血清CRP水平升高是IS的獨立危險因素[18-20]。在影響血清CRP水平的因素中，遺傳因素發(fā)揮了39%～52%的作用[21-23]，因此進(jìn)一步對CRP基因SNP的研究有著重要的意義。

本研究結(jié)果顯示，rs1800947 G、C等位基因分布有差異，表明攜帶rs1800947等位基因C的個體患IS的可能性更大。經(jīng)多元Logistic回歸校正相關(guān)危險因素后，與GG基因型相比，rs1800947 GC基因型增加了IS的發(fā)病風(fēng)險。日本Morita等[24]對152例IS患者和304例老年正常人群進(jìn)行研究，使用TaqMan探針對CRP基因rs1800947進(jìn)行基因分型，校正相關(guān)危險因素后發(fā)現(xiàn)，相對rs1800947的GG基因型而言，GC是IS的獨立危險因素〔95%CI(1.3，10.9)，P=0.016〕，本研究結(jié)果與其報道一致。但Ladenvall等[14]在2006年對瑞典600例IS患者和600例正常對照者進(jìn)行的病例對照研究，運用TaqMan探針對CRP基因進(jìn)行基因分型，結(jié)果卻未發(fā)現(xiàn)IS與rs1800947基因型具有相關(guān)性〔OR=1.14，95%CI(0.81，1.61)〕。國內(nèi)Liu等[16]在2008年應(yīng)用PCR-RFLP檢測222例IS/TIA患者(122例單純顱內(nèi)動脈粥樣硬化病變者和100例單純顱外動脈粥樣硬化病變者)及227例對照組的CRP基因rs1800947進(jìn)行基因分型，結(jié)果提示IS/TIA組與對照組的rs1800947基因型及等位基因頻率均無差異?？梢钥闯?，rs1800947 SNP與IS風(fēng)險的相關(guān)性研究尚有爭議。

本研究中未發(fā)現(xiàn)rs3093059基因型與IS發(fā)病風(fēng)險間有關(guān)聯(lián)。一項來自美國國家心肺血液研究院(NHLBI)以家庭為基礎(chǔ)的大型橫斷面研究利用焦磷酸測序技術(shù)對1 296例高加索人CRP基因rs3093059進(jìn)行基因型分析，結(jié)果亦未發(fā)現(xiàn)rs3093059與心血管疾病之間存在關(guān)聯(lián)[15]。國內(nèi)Shen等[25]對584例中國IS患者與993例相匹配的對照者進(jìn)行的一項病例對照研究，結(jié)果表明rs3093059與IS間存在相關(guān)性，rs3093059的加性模型、顯性模型以及等位基因頻率分布的OR值及95%CI分別為0.697(0.528，0.921)、0.671(0.487，0.923)、0.811(0.666，0.988)。這些有爭議的結(jié)果可能是由于種族、樣本量以及研究設(shè)計方法的不同所致。

本研究結(jié)果顯示，CRP基因中的rs1800947 GC基因型與SAA有關(guān)，而與LAA及CE無關(guān)，這與德國的Kuhlenbaeumer等[26]研究相一致。SAA主要由腔隙性腦梗死和腦白質(zhì)疏松等構(gòu)成。腔隙性腦梗死被認(rèn)為是由小穿支動脈的脂質(zhì)透明樣變性和微細(xì)血管硬化，由于原位血栓形成所造成；而腦白質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制有待闡明。SAA的發(fā)病機(jī)制主要為血液運輸管道的結(jié)構(gòu)改變、血管舒縮調(diào)節(jié)障礙[27]、血-腦脊液屏障功能破壞[28]以及細(xì)胞間液重吸收障礙[29]。有研究表明，在SAA中發(fā)現(xiàn)炎性內(nèi)皮細(xì)胞的激活以及內(nèi)皮功能的紊亂。發(fā)生機(jī)制可能是CRP作為一種急性炎性時相反應(yīng)指標(biāo)，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生[30-31]，通過受體介導(dǎo)的趨化反應(yīng)募集單核細(xì)胞[32-33]，誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生組織因子[34]，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起SAA。然而，先前的一些研究并未顯示CRP基因的遺傳變異與SAA有關(guān)[35-36]。

本研究進(jìn)一步評價這兩個SNP位點及環(huán)境因素的交互作用與IS的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸煙狀態(tài)與rs1800947 GC基因型，飲酒狀態(tài)與rs1800947 GC基因型之間存在交互作用。與rs1800947 GG基因型且無吸煙史、飲酒史的個體相比，rs1800947 GC基因型且有吸煙史、飲酒史的個體患IS的風(fēng)險上升，提示GC基因型與吸煙、飲酒的交互作用在IS的發(fā)生效應(yīng)上有放大作用。國外學(xué)者Humphries等[37]提出，吸煙可能通過內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞核的轉(zhuǎn)錄因子并刺激肝細(xì)胞合成CRP，CRP可作用于內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)，引起血液中的一些炎性細(xì)胞移行至內(nèi)皮下，并釋放一些炎性遞質(zhì)從而進(jìn)一步損傷內(nèi)皮功能[38]。飲酒與炎性反應(yīng)的并存可能通過改變血液凝固和纖維蛋白溶解等機(jī)制而增加IS的易患性。

綜上所述，CRP基因rs1800947 GC基因型參與了IS及其SAA的發(fā)生，并發(fā)現(xiàn)其與吸煙、飲酒間存在交互作用。CRP基因rs1800947位點的多態(tài)性為IS的危險因素提供了新的證據(jù)。本研究為病例對照研究，樣本量較小，需要謹(jǐn)慎分析結(jié)果，可進(jìn)一步行大樣本及高質(zhì)量前瞻性研究論證。

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